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硝基酚是化工合成的重要原料,广泛用于农药、炸药、染料等有机合成领域。这些化工产品如有机磷农药和硝基酚类除草剂在自然环境中水解产生对硝基酚(PNP)。PNP具生理毒性且难降解,是国标规定的三级污染物(危害性属最高一级)。PNP积累成为目前备受关注的环境问题。高效降解硝基酚污染、修复环境和保障公共健康已成为国内外研究者关注的热点问题。微生物酶法降解硝基酚具备高效、低成本和对环境友好的优点,已成为治理硝基酚污染的重要技术。本论文从PNP高效降解菌中克隆表达并分离纯化了PNP降解关键酶——偏苯三酚-1,2-双加氧酶(PnpC),研究了重组酶的表达条件及催化特性。本研究以PNP高效降解菌Pseudomonas sp. HS-D38、Bacillus cereus HS-MP12和Bacillus cereus HS-MP13基因组为模板,PCR扩增偏苯三酚1,2-双加氧酶基因(分别编号为pnpC1/2/3)。PCR产物克隆到pMD-18,之后亚克隆到表达载体pET-28, pET-pnpC1/2/3分别转化E.coli BL21(DE3), IPTG诱导高效表达重组PnpC1/2/3。优化表达条件,比较PnpC1/2/3可溶性表达差异。Ni-NTA亲和色谱纯化重组PnpC1 (HS-D38)并分析其催化特性。结果表明：pnpC1/2/3开放阅读框均为873 bp,同源性为99%,编码蛋白质相对分子量约为33 KD；37或20℃下,pnpC1/2/3在Ecoli BL21中均可高效表达,表达产物对邻苯二酚有邻位开环活性；37℃下,重组PnpC1/2/3都以包涵体表达为主,可溶性表达量很低；20℃下,重组PnpC1/3主要为可溶性表达,但重组PnpC2仍为包涵体表达；氨基酸序列比对表明：PnpC1/2差异为T12I/A202V, PnpC2/3差异为T12I/A202V/K230R,而PnpC1/3差异仅为K230R；重组PnpC1/2/3对邻苯二酚的开环活性分别为6.8、2.0和8.6 U/mL,比活力分别为0.25、0.22和0.29 U/mg；重组PnpC1经Ni-NTA亲和色谱分离可达到电泳纯,纯酶比活力9.3 U/mg,纯化倍数37.2,活力收率23.8%；纯化后,重组PnpC1催化邻苯二酚开环反应的最适温度45℃,最适pH5.0,Km 21.95μmol/L,Vmax 2.68μmol/(min·mg), Fe3+、Cu2+、Fe2+、Zn2+和Co2+为激活剂,Ni2+为抑制剂。本研究为进一步分析微生物PNP降解机制奠定了基础,同时为PnpC在PNP生物酶修复领域的应用提供了必要的实验依据。