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第一部分鸢尾素缺失对小鼠骨质的影响目的:对鸢尾素前体纤维连接蛋白III型结构域蛋白5(FNDC5)全基因敲除小鼠(FNDC5-/-)以及同窝出生的野生型(WT)小鼠进行骨量分析,观察鸢尾素缺失对小鼠骨质的影响。方法:选取24只4周龄雄性经基因型鉴定为FNDC5-/-纯合子小鼠,及24只同周龄同窝出生的雄性WT小鼠,两种小鼠都按每组6只随机分4组,分别在SPF级条件下进行饲养至6周、12周、18周、24周,并在对应的周龄收取相应组别小鼠的血清及股骨标本,并对骨组织进行Micro-CT扫描,分析骨相关参数,组织学染色,及Elisa检测血清中I型前胶原氨基端肽(P1NP)和I型胶原交联羧基端肽(CTX)的含量。结果:(1)通过对同周龄小鼠股骨Micro-CT扫描并分析骨相关参数,发现6周FNDC5-/-小鼠的骨密度(BMD)低于WT小鼠,并有统计学差异(P<0.05),其余各项参数骨体积分数(BV/TV)、骨小梁厚度(Tb.Th)、骨小梁厚度(Tb.N)、骨小梁分离度(Tb.Sp)均无统计学差异(P>0.05),从12周龄开始FNDC5-/-组小鼠的骨量明显低于WT小鼠,BV/TV、Tb.Th、Tb.N、BMD均表现出统计学差异(P<0.05);(2)通过H&E和Masson染色可以看到FNDC5-/-组小鼠股骨相比于WT组骨小梁排列稀疏、紊乱,新生骨量减少,免疫组化染色检测成骨细胞特异性转录因子(Osterix)明显减少,TRAP染色可见TRAP阳性细胞数量增多,差异具有统计学意义(P<0.001);(3)Elisa结果提示FNDC5-/-小鼠血清中CTX表达增加,P1NP表达降低,差异均具有统计学意义(P<0.05)。结论:小鼠体内鸢尾素缺失会降低小鼠的成骨能力,增加骨吸收能力,显著降低骨量。第二部分内源性鸢尾素缺失对小鼠成骨细胞分化和破骨细胞活化的影响目的:利用FNDC5-/-小鼠及WT小鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)诱导成骨分化,骨髓源性巨噬细胞(BMMs)诱导破骨活化,研究内源性鸢尾素对BMSCs成骨分化及对BMMs破骨活化的影响。方法:提取12周龄FNDC5-/-小鼠及WT小鼠BMSCs,体外分离培养,进行成骨诱导分化,通过碱性磷酸酶(ALP)染色及ALP活性测定观察诱导7天后成骨标志物ALP的数量及其活性;同时通过RT-PCR检测成骨相关基因(COL1、OPN、RUNX2)的表达;在诱导第14天进行茜素红(ARS)染色,观察矿化结节的形成情况。提取两组小鼠BMMs,诱导破骨活化,在第3天检测破骨相关基因(TRAP、OSCAR)的表达;在第6天进行TRAP染色,观察破骨细胞形成的数量和大小。结果:(1)提取12周龄FNDC5-/-小鼠及WT小鼠原代BMSCs,经过流式细胞术(FAC)鉴定后进行成骨分化诱导,ALP染色显示FNDC5-/-组小鼠的BMSCs经过7天成骨诱导后,碱性磷酸酶着色明显浅于WT组,ALP活力明显降低,成骨相关基因COL1、OPN、RUNX2的表达明显低于WT组,ARS染色及定量分析可以明显看到矿化结节形成也低于WT组;(2)BMMs在破骨诱导3天后,FNDC5-/-组破骨相关基因TRAP、OSCAR表达高于WT组,诱导6天后TRAP染色可见FNDC5-/-组破骨细胞数量和大小都增加。结论:内源性鸢尾素缺失会降低小鼠BMSCs成骨分化能力,同时会增强小鼠BMMs的破骨活化能力,鸢尾素在小鼠体内可以双向调控小鼠的成骨分化和破骨活化,影响骨代谢平衡。第三部分鸢尾素通过BMP/SMAD信号通路调控BMSCs成骨分化目的:探索鸢尾素是否通过BMP/SMAD信号通路调控BMSCs成骨分化。方法:提取6-8周WT小鼠BMSCs并诱导成骨分化,同时加入重组鸢尾素处理,3天后收取细胞蛋白样本,通过Western Blot分析了BMP/SMAD信号转导通路中相关信号蛋白Smad1/5/9、P-Smad1/5/9、Smad4、BMP2的表达,在诱导第7天进行ALP染色及活性测定,并通过RT-PCR检测成骨基因的表达,在诱导14天进行ARS染色,观察矿化结节的形成;收取12周龄FNDC5-/-小鼠及WT小鼠股骨标本,通过免疫组化染色,检测了P-Smad1/5/9在股骨近端骨小梁的表达;通过对冰冻切片的免疫荧光染色检测了骺板区BMP2的表达;取12周龄FNDC5-/-小鼠及WT小鼠新鲜股骨组织,提取BMSCs进行成骨诱导分化,并加入重组鸢尾素进行处理,3天后进行PSmad1/5/9免疫荧光染色;提取两组小鼠骨组织蛋白样本,通过Western Blot分析了两组小鼠在骨组织中P-Smad1/5/9的表达。结果:(1)6-8周WT小鼠BMSCs成骨诱导过程中,经重组鸢尾素处理3天后,Western Blot结果可以很明显的看到处理组P-Smad1/5/9、Smad4、BMP2表达增强,P-Smad1/5/9/Smad1/5/9比例增加,ALP染色可见鸢尾素处理组碱性磷酸酶的活性增加,RT-PCR可见处理组骨相关基因(RUNX2、ALP、OPN)表达增强,茜素红染色显示处理组矿化结节的形成明显增多,差异具有统计学意义(P<0.05);(2)12周龄FNDC5-/-及WT小鼠股骨近端P-Smad1/5/9免疫组化染色可见,FNDC5-/-组表达明显低于WT组小鼠,骺板区免疫荧光染色可以看到,FNDC5-/-小鼠BMP2表达明显低于WT组,差异具有统计学意义(P<0.001);(3)骨组织Western Blot结果显示,FNDC5-/-小鼠P-Smad1/5/9的条带明显弱于WT组;(4)12周龄的FNDC5-/-及WT小鼠BMSCs的细胞免疫荧光显示WT小鼠P-Smad1/5/9的阳性细胞数高于FNDC5-/-组(P<0.0001),在加入鸢尾素后,两组P-Smad1/5/9阳性细胞数均显著增加。结论:鸢尾素可以通过BMP/SMAD信号通路调控成骨分化。