研究背景自1983年世界首例冻融胚胎移植(frozen-thawed embryo transfer, FET)取得临床妊娠成功以来,FET技术已广泛应用于人类辅助生殖技术领域。如何提高FET的成功率已成为生殖医学领域研究的热点之一。影响FET妊娠结局的主要因素有胚胎质量、子宫内膜与胚胎的同步性和子宫内膜容受性。由于冷冻周期多采用自然周期或模拟生理状态的激素替代周期,避免了刺激周期“着床窗”提前开放,具有较好的胚胎与内膜同步性。因而,在冷冻周期,胚胎质量和子宫内膜容受性尤为重要。在控制下超促排卵(controlled ovarian hyperstimulation, COH)过程中,血清雌孕激素水平的高低反映卵泡的分泌功能,代表卵巢对COH的反应程度,间接反映卵母细胞的质量。同时,子宫内膜是雌孕激素作用最直接的靶器官,内膜只有在雌孕激素的严格调控下,才能保证胚胎成功植入；子宫内膜也是促黄体生成素(1uteinizing hormone, LH)作用的靶器官,通过雌孕激素的正、负反馈系统可引起血清LH的变化,LH可能成为内膜容受性新的生物学标记。血清激素是影响“种植窗”期子宫内膜容受性的关键因素。因此,血清激素在辅助生殖技术(assisted reproductive technology,ART)中扮演着非常关键的角色,是临床医生决定方案调整的重要指标,也是体外受精-胚胎移植(in vitro fertilization and embryo transfer, IVF-ET)结局的重要预测因子,具有重要的临床价值。目前,国内外有不少关于刺激周期不同时期的血清激素与IVF-ET妊娠率及着床率关系的报道。然而,监测血清激素水平对FET妊娠结局有无临床意义,国内外研究较少,且结论尚不一致。为此,本研究着眼刺激周期人绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin, hCG)注射日和激素替代疗法-冻融胚胎移植(hormone replacement therapy-frozen embryo transfer, HRT-FET)周期黄体酮注射日的血清激素,分别探讨血清激素水平对FET妊娠结局的影响,寻找预测FET结局的指标,从而,为改进临床监测指标提供依据,确定冻融胚胎移植时机提供参考。第一部分注射hCG日血清激素水平对冻融胚胎移植结局的预测价值目的探讨注射hCG日血清激素水平对FET妊娠结局的影响,为改进临床监测指标提供依据以及确定胚胎移植时机提供参考。方法1.研究对象回顾性的分析2009年7月～2011年12月在南方医院生殖医学中心第一次接受FET周期共466个。其中299个自然周期,167个无垂体降调节的激素替代周期,均符合以下研究标准：1.1纳入标准：(为满足以下所有条件)(1)年龄<40岁的不孕症患者；(2)促排卵周期采用标准黄体中期长方案者；(3)新鲜周期移植失败或未移植,2-3个月后行自然周期或无垂体降调节的激素替代冻融胚胎移植；(4)移植2个或3个第3天冻融胚胎；(5)冻融胚胎移植前至少2个月未服用激素类药物；(6)新鲜周期和冻融周期基础FSH<10mlU/mL。1.2排除标准：(为符合以下任一)(1)子宫内膜异位症、子宫腺肌症、宫腔粘连、宫腔积液、子宫内膜息肉、内膜结核、内膜增生等有明确影响子宫内膜环境因素的患者；(2)新鲜周期行coasting方案者；(3)冻融周期行辅助孵化者；(4)冻融周期施行囊胚移植或两步移植者。2.FET妊娠结局相关性指标的确定方法运用受试者诊断特征(ROC)曲线。3.分组标准根据注射hCG日E2水平分为四组：A1组<2000.00pg/ml,A2组2000.01～3000.00pg/ml,A3组3000.01～4000.00pg/ml,A4组>4000.01pg/ml。根据子宫内膜的准备方式分组：B1组：自然周期,B2组：无垂体降调节的激素替代周期。若注射hCG日E2水平≥3000.00pg/ml,根据患者行冷冻移植的原因分组：C1组：新鲜周期移植失败后首次行FET,C2组：为防止OHSS发生,取消新鲜胚胎移植,全胚胎冷冻后首次行FET。4.注射hCG日的确定标准当≥2个主导卵泡直径在18mm以上时,当晚10时肌注hCG5000～10000IU。5.血清激素水平测定进入周期前一个月的自然月经周期第3天8AM～10AM空腹抽血测定基础状态下FSH、LH和E2。注射hCG日当天上午使用促排卵药物前即9AM之前抽取静脉血3ml,并于当日采用化学发光法分析测定血清E2、LH和P。各激素的批间变异系数及批内变异系数均小于5%。血清E2水平超过4300pg/ml,稀释后测定。6.卵巢高反应的定义注射hCG日E2水平≥3000.00pg/ml,和/或获卵数≥15个。7.冻融周期子宫内膜准备方式采用自然周期或无垂体降调节的激素替代周期。8.实验室处理、胚胎冻存与复苏、黄体支持及妊娠诊断采取IVF/ICSI授精,取卵后72h根据患者年龄、既往移植情况及有无OHSS症状选取2-3枚质量较好的胚胎进行移植,剩余胚胎征得患者同意后予以冻存。胚胎冷冻与复苏、黄体支持及妊娠诊断的诊断方法按照本中心常规。9.统计学分析采用SPSS13.0软件包对数据库进行统计学分析,结果以X±S表示。运用ROC曲线分析注射hCG日血清激素水平与FET妊娠结局之间的关系。计量资料满足方差齐性条件时,采用独立样本t检验或one-way ANOVA,不满足方差齐性条件,则采用非参数的Kruskal-WallisH检验；率的比较用χ2检验；双变量相关分析中,对于正态分布的双变量资料,用Pearson相关系数分析；非正态分布的双变量资料,用Spearman相关系数分析。以P<0.05为差异有统计学意义。结果1.通过ROC曲线分析,结果显示：注射hCG日血清E2水平能够预测FET妊娠结局(AUC=0.57,P=0.011),但其准确度较低；而注射hCG日血清LH和P水平不能预测FET妊娠结局,AUC分别为0.50和0.48(P>0.05)。2.随着注射hCG日E2水平的升高,hCG日P水平、获卵数、成熟卵数、总优胚数及冷冻胚胎数显著增加,取消新鲜移植比率和冷冻移植优胚率显著增高,而Gn应用总量显著减少(P<0.05),与A1组和A2组相比,A3组和A4组的胚胎种植率及临床妊娠率较高,差异有显著性(P<0.05)。3.注射hCG日E2水平与基础FSH、年龄和Gn启动量均无相关性(P>0.05)；与Gn应用总量呈负相关关系(r=-0.232,P<0.001),但二者的相关性较弱；而与获卵数呈正相关关系(r=0.609,P<0.001)、与成熟卵数呈正相关关系(r=0.596,P<0.001)、与总优胚数呈正相关关系(r=0.319,P<0.001)、与冷冻胚胎数呈正相关关系(r=0.558,P<0.001),其两变量间的相关性均非常密切。4.自然周期移植日内膜厚度高于HRT周期(P=0.003),但两者可获得相似的胚胎种植率和临床妊娠率(P>0.05)。在自然周期中,四组间临床妊娠率比较有显著性的差异(P=0.042),其中注射hCG日E2水平控制在3000-4000pg/ml冷冻周期的妊娠率最高。在HRT周期中,随着hCG日E2水平的升高,胚胎种植率和临床妊娠率逐渐增高,胚胎种植率比较有显著性差异(P=0.003),而临床妊娠率差异比较,无统计学意义(P=0.207)。5.卵巢高反应者行全胚胎冷冻后移植与新鲜移植失败后冷冻移植比较,前者的基础FSH水平和Gn应用总量较低,hCG日E2和P水平较高,获卵数、成熟卵数、总优胚数及冷冻胚胎数较多,而移植胚胎数显著减少(P=0.000),移植优胚率显著增高(P=0.000),胚胎种植率显著增高(P=0.004)；但两者的临床妊娠率相似(P=0.775)。6.卵巢高反应患者行不同的子宫内膜准备方法比较,自然周期移植日内膜厚度显著高于HRT周期(P=0.006),但两组的胚胎种植率及临床妊娠率比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论1.注射hCG日E2水平与卵巢反应性及胚胎质量密切相关,对FET结局有预测价值,血清E2水平≥3000pg/ml预测价值最高。2.胚胎质量(移植优胚率)是影响FET成功的关键因素。自然周期和HRT周期可获得相似的妊娠结局,应根据患者的具体情况实施,权衡利弊,采取个体化治疗方案。第二部分注射黄体酮日血清E2和LH水平对无垂体降调节的HRT-FET周期妊娠结局的影响目的探讨在无垂体降调节的HRT-FET周期中,黄体酮注射日血清E2和LH水平对胚胎移植时机的选择和妊娠结局的影响。方法1.研究对象回顾性的分析2010年3月～2011年12月在南方医院生殖医学中心接受无垂体降调节的HRT-FET共170个周期完整的病历资料,均符合以下研究标准：1.1纳入标准：(为满足以下所有条件)(1)年龄<40岁的不孕症患者；(2)促排卵周期采用标准黄体中期长方案者；(3)新鲜周期基础FSH<10mlU/mL；(4)FET周期与促排卵周期至少间隔3个月；(5)有胚胎冻存且移植2个或3个第3天冻融胚胎；(6)行FET前至少2个月未服用激素类的药物；(7)冻融周期月经第2-3天,抽血查FSH、LH、E2均在早卵泡期水平,阴道超声检查子宫附件未见异常。1.2排除标准：(为符合以下任一)(1)子宫内膜异位症、子宫腺肌症、宫腔粘连、宫腔积液、子宫内膜息肉、内膜结核、内膜增生等有明确影响子宫内膜环境因素的患者；(2)供一受卵患者；(3)新鲜周期行coasting方案者；(4)冻融周期行辅助孵化者；(5)施行囊胚移植或两步移植方案者；(6)黄体酮注射日阴道B超检查发现有优势卵泡生长者；(7)服用戊酸雌二醇片超过21天而子宫内膜仍未达到7mm者；(8)由器质性病变引起的排卵障碍者。2.分组标准按照注射黄体酮日血清E2质量浓度的百分位数分为三组：A1组<25th(<221.70pg/ml),A2组25th～75th(221.70～394.05pg/ml),A3组>75th(>394.05pg/ml)。按照血清LH质量浓度的百分位数分为三组：B1组<25th(<10.38IU/L),B2组25th～75th(10.38～20.33IU/L),B3组>75th(>20.33IU/L)。根据患者既往月经周期监测排卵情况分两组,即排卵正常组和排卵障碍组。3.血清激素水平测定月经第2-3天测定基础血清FSH、LH (?)口E2；注射黄体酮日测定血清E2、LH和P。患者均在8:00AM-9:00AM抽静脉血,采用全自动化学免疫发光法进行激素测定。4.实验室处理、胚胎冻存与复苏、黄体支持及妊娠诊断均同第一部分5.注射黄体酮日的确定标准当戊酸雌二醇片的用药时间≥12天,且子宫内膜厚度≥7mm时肌注黄体酮,使内膜由增殖期转化为分泌期。6.统计学方法采用SPSS13.0软件处理包对数据库进行统计学分析,结果以x±s表示。计量资料满足方差齐性条件时,采用独立样本t检验或one-way ANOVA,不满足方差齐性条件,则采用非参数的Kruskal-Wallis H检验；率的比较用χ2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。结果1.A1、A2和A3组促排卵周期和冻融胚胎移植周期相关特征比较,差异均无统计学意义,随着E2百分位数的升高,三组间胚胎种植率及临床妊娠率逐渐降低,但无显著性差异(P=0.05)。2.B1、B2和B3组口服戊酸雌二醇片总量差异比较有统计学意义(P=0.019),而三组促排卵周期和冻融胚胎移植周期的其他相关特征、冻融周期的胚胎种植率及临床妊娠率比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。3.与排卵正常组相比较,排卵障碍组患者的促排周期年龄较小、基础FSH较低、冷冻移植胚胎数较少,差异有统计学意义(P<0.05)；而两组患者注射黄体酮日E2水平、LH水平、内膜厚度、LH峰所占比率及移植优胚率间的差异比较,均无统计学意义(P>0.05)；两组可获得相近的胚胎种植率及临床妊娠率。4.在注射黄体酮日LH>10.00IU/L的患者中,与排卵正常组相比,排卵障碍组患者的基础FSH和有宫腔操作史比率较低,全胚胎冷冻比率较高,注射黄体酮日内膜较厚及移植胚胎数较少,差异均有统计学意义(P>0.05)；但两组患者的胚胎种植率及临床妊娠率差异比较无显著性(P>0.05)。结论1.卵巢功能正常的患者在行无垂体降调节的HRT-FET时,允许内膜向容受性转化的血清E2和LH范围可能很大,注射黄体酮日的E2和LH水平不会影响FET妊娠结局。2.在无垂体降调节的HRT-FET周期中,无论排卵正常与障碍者均可出现LH峰,且所占比例无差异。3.是否出现LH峰值对无垂体降调节的HRT-FET周期妊娠结局无影响。4.无垂体降调节的HRT可适用于排卵障碍和排卵正常患者。