研究背景全身麻醉是否会对婴幼儿及学龄前期儿童的学习和记忆产生不利影响一直是医学研究的热点和社会关注的焦点。早在2008年,美国麻醉医师协会(american society of anesthesiologists,ASA)就曾公布了三项关于小儿全麻术后中远期认知功能改变的临床调研报告,报告中明确指出新生儿期或幼年期多次(两次以上)接受全身麻醉,其发生远期认知功能改变的风险就会增加。因此,深入探究全麻药物对学龄前儿童学习和记忆的影响意义重大。七氟烷(sevoflurane,SEVO)是目前在临床上广泛应用的吸入性全身麻醉药,适用于各年龄阶段、各部位手术的麻醉诱导和维持。由于七氟烷诱导具有起效迅速、过程平稳、无痛苦以及容易被接受等优点,因此特别适合不能配合的患儿。随着七氟烷在儿科手术中的广泛使用,有学者发现七氟烷对发育期哺乳动物的大脑具有潜在的神经毒性,并可导致远期学习和记忆功能障碍,但具体机制不清。回顾性临床研究发现,1岁前曾接受七氟烷麻醉的儿童在6～11岁时会出现记忆功能障碍。动物实验表明,7日龄小鼠吸入2.4%的七氟烷4小时,吸入后第7周表现出明显的空间学习和记忆能力损害。一项针对恒河猴的研究发现,6～10日龄的恒河猴吸入七氟烷4小时,并间隔14天和28天后再次吸入,在6月龄时进行测试,结果发现记忆功能显著受损,且记忆能力的下降可持续至1～2岁。虽然临床研究和动物实验均提示七氟烷对发育期大脑具有毒性作用,但由于影响因素复杂多变,特别暴露年龄、给药方式、给药途径及给药浓度等方面存在很大不同,所以七氟烷对发育期大脑学习和记忆功能的损害作用及程度仍存争议。学习和记忆作为大脑的最基本功能之一,是一个动态的、复杂的过程,其形成和表达涉及多种分子生物学机制。目前,关于七氟烷影响学习和记忆机制的研究主要集中在调控学习和记忆相关蛋白表达、影响神经元突触可塑性以及调节细胞凋亡等方面。首先,七氟烷是通过激活γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)受体和/或抑制N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartic acid,NMDA)受体来发挥其麻醉作用。NMDA受体介导兴奋性突触传递中的慢成分,主要参与调控长时程增强(long-term potentiation,LTP)和长时程抑制(long-term depression,LTD),是与学习和记忆密切相关的重要分子。GABA作为中枢神经系统中最重要的抑制性神经递质,同样与学习和记忆密切相关。其次,七氟烷还可通过调控相关分子的表达,进而干扰学习和记忆过程,如升高β-淀粉样蛋白的表达、下调脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)的表达等,但具体机制仍需进一步研究。再者,突触的可塑性是学习和记忆的重要机制,包括LTP和LTD,研究发现七氟烷能够抑制LTP的形成,这可能是七氟烷导致学习和记忆功能受损的机制之一。最后,七氟烷还可引起神经细胞的凋亡,尤其是发育期的神经元,从而导致学习和记忆能力的下降。MicroRNA(miRNA)是真核细胞生物中广泛存在的一类由内源基因编码长约21～23个核苷酸的非编码单链小RNA分子,参与转录后基因表达的调控。研究证实,miRNA可通过与靶基因mRNA互补配对来降解或抑制mRNA的翻译,从而调控靶基因的表达。真核生物细胞增殖的完整周期包括G0/G1期、S期、G2期和M期四个阶段。细胞周期进程中两个重要的节点分别是G1期向S期和G2期向M期的转变,分别受不同的周期蛋白依赖性激酶(cyclin-dependent kinases,CDK)及其激活的周期蛋白(cyclin)亚单位所严格调控。研究表明,周期蛋白A(cyclinA,CCNA)对维持S期和有丝分裂的起始至关重要,周期蛋白B(cyclin B,CCNB)与启动有丝分裂有关。研究证实,七氟烷可导致海马中大量基因的表达发生改变,并可损害新生大鼠的空间学习和记忆能力。那么,七氟烷所致基因表达的改变是否与miRNA的靶向调控有关?七氟烷是否可以通过影响细胞周期进程从而抑制细胞增殖?其具体机制又是什么?到目前为止尚未见相关报道。本研究将从行为学、分子生物学及基因调控等多个角度探究七氟烷致新生大鼠行为学改变与细胞周期蛋白表达和miRNA靶向调控之间的内在联系,阐明七氟烷对新生大鼠学习和记忆功能的影响及机制,为临床合理用药提供参考。第一部分七氰烷对新生大鼠学习和记忆的影响目的:观察七氟烷对新生大鼠学习和记忆的损害作用。方法:将出生4周龄的雄性SD大鼠随机分为对照组(CTL组)和七氟烷组(SEVO组),每组10只。CTL组暴露于正常的空气中4小时,SEVO组暴露于5%的七氟烷4小时,新鲜气体流量设为1.5 L/min。采用Morris水迷宫实验(定位航行试验和空间探索试验)和十字迷宫辨别回避任务(plus-maze discriminative avoidance task,PM-DAT)作为评价新生大鼠学习和记忆能力的指标;通过Western blotting检测海马BDNF的表达水平;运用Ki-67染色观察大鼠海马神经细胞的增殖活性。结果:Morris水迷宫实验发现,逃避潜伏期在两组中均随时间的延长而逐渐降低,两组之间有显著性差异(P<0.00l);与CTL组相比,SEVO组在七氟烷暴露后第4周和第6周测试时逃避潜伏期显著延长(P<0.05)。两组的路径长度也随时间的延长而逐渐缩短;与CTL组相比,SEVO组在第6周测试时路径长度显著延长(P<0.05),表明七氟烷暴露可显著损害新生大鼠的空间记忆能力。在PM-DAT测试中,SEVO组在封闭臂的停留时间显著长于CTL组(P<0.05),即七氟烷暴露后新生大鼠在训练期间花费的时间较长、表现较差;SEVO组在开臂停留时间也明显长于CTL组(P<0.05),即七氟烷暴露后新生大鼠在测试期间花费的时间较长、表现较差。与CTL组相比,SEVO组脑组织中BDNF水平显著下降,且海马Ki-67阳性增殖神经细胞数量显著减少(P<0.05)。结论:七氟烷可损害新生大鼠的学习和记忆能力,且这种损害作用可能与其下调脑内BDNF蛋白的表达以及抑制海马神经细胞的增殖有关。第二部分 七氟烷对HCN-2神经细胞增殖的影响及其分子机制目的:观察七氟烷对HCN-2神经细胞增殖的影响,并阐明其分子机制。方法:利用人源皮质神经元(human cortical neuron-2,HCN-2)细胞系进行体外细胞实验,在细胞水平上研究七氟烷对神经细胞增殖的影响。将相同数量的HCN-2细胞随机分为不同浓度七氟烷组(0.5%组、1%组、2%组、5%组)和对照组(空气比例为5%C02、21%O2及N2),48小时后进行Ki-67染色及DAPI染色分析神经细胞的增殖活性;采用Western blotting检测周期蛋白依赖性蛋白激酶(CDK)和细胞周期蛋白(CCNA1、CCNA2、CCNB1、CCNE1、CCNE2、CDK1、CDK2和CDK4)的表达水平;通过qPCR检测CCNA2 mRNA的表达水平。然后,利用生物信息学分析靶向CCNA2的miRNA,并检测其在七氟烷暴露后HCN-2细胞中表达的变化,以及通过质粒转染验证miRNA对CCNA2表达的调控作用。结果:Ki-67染色及DAPI染色显示,七氟烷可使Ki-67 阳性细胞数量和总细胞数量显著减少,且均呈浓度依赖性(0%vvs0.5%,0.5%vvsl%,1%vvs2%,2%vs 5%,均为P<0.05)。Western blotting检测CCNA1、CCNA2、CCNB1、CCNE1、CCNE2、CDK1、CDK2和CDK4蛋白的表达,结果发现,七氟烷暴露后只有CCNA2蛋白的表达水平显著降低,且呈浓度依赖性(0%vs 0.5%,0.5%vs 1%,1%vs 2%,2%vs 5%,均为P<0.05)。然而,进一步的实验表明HCN-2细胞中CCNA2 mRNA的表达却并没有发生改变(P>0.05)。经生物信息学分析后发现,大鼠CCNA2具有18种靶向miRNA。与CTL组相比,在这18种靶向miRNA中,七氟烷可显著上调miR-19-3p的水平。在HCN-2细胞中转染携带反义miR-19-3p的质粒可显著降低miR-19-3p的水平(P<0.05);而转染携带miR-19-3p的质粒则可显著增加miR-19-3p的水平(P<0.05),且CCNA2 3’-UTR的荧光素酶活性显著降低(P<0.05)。另外,过表达miR-19-3p可显著降低CCNA2的蛋白表达水平(P<0.05),而敲低miR-19-3p后CCNA2的蛋白表达水平明显增加(P<0.05)。结论:(1)七氟烷能够损害HCN-2神经元的增殖能力,其机制可能与其抑制转录后CCNA2蛋白的表达有关。(2)七氟烷可上调HCN-2细胞中miR-19-3p的水平;(3)在HCN-2细胞中,过表达miR-19-3p可降低CCNA2蛋白的水平,反之,CCNA2蛋白的水平增加。第三部分 七氟烷损害新生大鼠学习和记忆的分子机制目的:采用分子生物学方法,阐明七氟烷损害新生大鼠学习和记忆能力的分子机制,并探索miRNA-19-3p在其中的调控作用。构建携带反义miR-19-3p的AAV并进行双侧海马区注射,验证下调双侧海马区miR-19-3p的表达后对七氟烷所致神经细胞增殖及学习和记忆能力损害的保护作用。方法:构建表达反义miR-19-3p的AAV(AAV-as-miR-19-3p)和对照AAV(AAV-null)并转染HCN-2细胞,通过免疫荧光观察AAV-as-miR-19-3p转染细胞、AAV-null转染细胞和未转染细胞(Unt)中miR-19-3p的水平。然后,将AAV-as-miR-1 9-3p或AAV-null颅内注射到4周龄大鼠的双侧海马中,每组10只。注射后一周,同时将这些大鼠暴露于5%的七氟烷。采用Morris水迷宫实验和PM-DAT评价学习和记忆能力;通过Western blotting检测海马区BDNF的表达水平;采用Ki-67染色观察大鼠海马脑区神经元的增殖活性。结果:构建AAV-as-miR-1 9-3p并转染HCN-2细胞后,结果发现,AAV-null转染细胞与Unt细胞中miR-19-3p的水平无显著差异(P>0.05),而AAV-as-miR-19-3p转染细胞中miR-19-3p水平显著低于另外两组(P<0.05),且使miR-19-3p水平下降了约80%。大鼠双侧海马注射AAV-as-miR-1 9-3p或AAV-null后,结果发现,AAV-as-miR-19-3p组可显著改善大鼠在Morris水迷宫和PM-DAT测试中的逃避潜伏期和路径长度等指标(P<0.05)。而且,miR-19-3p敲低可显著升高脑组织中BDNF的水平并增加脑海马Ki-67阳性增殖神经元的数量(P<0.05)。结论:(1)七氟烷可通过上调miR-19-3p抑制转录后CCNA2蛋白的表达来损害新生大鼠的学习和记忆能力;(2)双侧海马内注射AAV-as-miR-19-3p可抑制miR-19-3p表达的上调,对七氟烷暴露后神经细胞增殖以及新生大鼠学习和记忆功能损害具有保护作用。