论文部分内容阅读
目的:呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)是婴幼儿下呼吸道感染的最重要病原,也是造成老年人和免疫缺陷成人高患病率和死亡率的重要原因。接种疫苗是预防传染性疾病的重要措施,接种者自然感染RSV后往往导致加重的Th2型优势应答和肺部炎症性病理损伤,这是RSV疫苗成功的主要障碍。几十年来,阐明RSV的感染机制和疫苗增强性肺部免疫病理的发病机制一直是RSV研究领域的最前沿,是研制安全有效的治疗措施和RSV疫苗的重要理论基础。
发病机制的研究离不开理想的实验动物模型。小鼠肺炎病毒(pneumonia virus of mice,PVM)与人RSV(hRSV)同属副粘病毒科、肺病毒亚科、和肺病毒属,小鼠是PVM的天然宿主,极少量病毒即可导致严重感染,PVM感染小鼠可以复制RSV严重感染婴幼儿的临床特征和炎症病理。本研究用PVM感染新生4-7天和成年6-9周的雌性BALB/c小鼠,考察PVM感染后在新生小鼠和成年小鼠模型中诱导的免疫应答、炎症反应和肺部病理变化,是发展有效的治疗措施和研制安全有效的RSV疫苗的重要理论基础。
方法:
1制备PVM并用BHK-21细胞滴定。
2动物实验
将新生4-7天和成年6-9周BALB/c小鼠随机分为4组,每组6只,分别为:(1)新生4-7天BALB/c小鼠感染组,(2)新生4-7天BALB/c小鼠对照组,(3)6-9周BALB/c小鼠感染组,(4)6-9周BALB/c小鼠对照组。新生组用375TCID50 PVM感染,成年组用,500 TCID50 PVM感染。
2.1每天称量小鼠体重,观察体重变化。
2.2取新生感染组和新生对照组感染后1、3、5、7、9、11、14和18天的肺组织,提取总RNA,用半定量PCR扩增PVM基因SH,考察小鼠肺组织中PVM感染情况。
2.3将肺冲洗液中的细胞经瑞士.吉姆萨染色,计数各种有核细胞,观察感染后肺部炎症细胞的变化。
2.4留取感染后3、7、14天小鼠的肺组织做病理切片,HE染色,观察肺组织中炎症浸润及组织损伤。
2.5用实时定量PCR.检测感染后1、3、5、9、14天肺组织的Th1型细胞因子IFN-γ、IL-12,Th2型细胞因子IL-5、IL-6、IL-13,干扰素IFN-α、IFN-β,肿瘤坏死因子TNF-α,趋化因子MCP-1、MIP-1α、CCL5、MCP-3,黏液因子gob5,考察感染后Th1/Th2应答情况,以及肺部炎症反应情况。
2.6感染后14天取血分离血清,用ELISA法测定血清IgG抗体效价。
2.7成年组的检测指标同新生组,不同的是成年组增加了感染后4h组。
结果:
1制备了实验所需的PVM病毒,滴度为tCID50=107.5/ml
2体重变化情况
新生小鼠感染组与新生对照组相比,感染后4天体重减轻,感染后7天体重下降至最低,然后体重开始慢慢增加,到14天与对照组无差异。
成年感染组与成年对照组相比,感染后3天体重开始迅速下降,5天降至最低,7天开始体重慢慢增加,8天逐渐恢复正常。
3半定量PCR扩增PVM基因SH
新生小鼠感染PVM后1天基因SH条带亮度比较弱,感染后5天条带最亮,感染后7天和9天条带亮度较弱,至18天消失。
成年小鼠感染PVM4小时后基因SH条带亮度较新生小鼠感染1天后亮,感染后3天和5天达高峰,7天、9天稍微减弱,14天进一步减弱,至18天消失。
4肺组织HE染色
新生和成年对照组小鼠,肺泡壁结构完整,无水肿,周围仅有少量炎性细胞;新生感染组与对照组相比,感染后3天肺间质炎性细胞增多,肺泡壁增厚;感染后7天明显增多,肺泡壁增厚,水肿,其中大部分为淋巴细胞,可见单核-巨噬细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞,14天炎症减弱;成年感染组感染后3天和7天,均有大量炎性细胞浸润,肺泡壁严重充血、水肿,有出血点,肺泡间隔融合,14天炎症减弱。
5支气管肺泡灌洗液中观察炎性细胞变化情况
成年小鼠感染PVM3天和7天后支气管肺泡灌洗液中细胞总数均大于新生感染组,成年组感染后3天中性粒细胞比例是53.25%,7天组中性粒细胞比例是67.00%,而新生小鼠感染后3天中性粒细胞比例是0.00%,7天组中性粒细胞比例是27.00%,另外,成年组淋巴细胞比例也高于新生小鼠,表明成年小鼠感染PVM后比新生感染组炎性细胞浸润程度严重。
6 ELISA法检测小鼠感染14天后血清中特异性抗体IgG
与对照组相比,新生感染组和成年感染组均产生了IgG抗体,且有显著性差异(P<0.05),成年感染组IgG抗体效价(1/400)高于新生感染组(1/200)的效价。
7肺组织中细胞因子的表达情况
新生小鼠感染PVM后3天肺组织的Th1型细胞因子IFN-γ显著高于对照组(P<0.05),之后继续升高,9天时是对照组的150倍;感染后IL-12表达量与对照组无差异(P>0.05)。
成年小鼠感染PVM后肺组织Th1型细胞因子IFN-γ和IL-12表达量均与对照组有显著差异(P<0.05),IFN-γ表达量感染后1天即显著高于对照组,5天时最高,是对照组的133倍,9天开始下降。IL-12感染后5天是对照组的2倍(P<0.05),之后与对照组无差异(P>0.05)。
新生小鼠感染后Th2型细胞因子IL-5、IL-13与对照组无差异(P>0.05),成年小鼠感染后IL-5与对照组无差异(P>0.05),感染后5天IL-13表达量是对照组的4倍(P<0.05).
新生小鼠感染后3天肺组织IL-6表达量达高峰(P<0.05),是对照组的17倍,5天恢复;成年组IL-6表达量5天达高峰,是对照组的18倍。
在成年和新生鼠中,IFN-α均于感染早期迅速增加,之后急速下降;IFN-β在新生鼠中的表达动力学与IFN-α一致,但在成年鼠中IFN-β在感染早期开始表达,5天才达高峰。
新生小鼠感染后9天肿瘤坏死因子TNF-α是对照组的30倍(P<0.05),而成年小鼠感染后4小时TNF-α肺部表达量是对照组的76倍(P<0.05),1天后逐渐降低,至14天和对照组无差异(P>0.05)
新生小鼠感染后趋化因子MCP-1、MCP-3、MIP-1α和CCL5均与对照组有显著差异(P<0.05),感染后3天肺组织MCP-1表达量是对照组的41倍,至14天低于对照组(P<0.05).感染后5天肺组织MCP-3表达量是对照组的118倍,至14天与对照组无差异(P>0.05),MIP-1α感染后5天是对照组的21倍;感染后3天CCL5是对照组的2倍(P<0.05);成年小鼠感染PVM后5天MCP-1是对照组的120倍(P<0.05),至14天是仍高于对照组,MCP-3感染后5天是对照组的195倍(P<0.05),14天仍高于对照组,MIP-1α感染后1天是对照组的50倍(P<0.05),至14天时也仍高于对照组(P<0.05),感染后1天CCL5是对照组的5.5倍(P<0.05)。
黏液因子gob5的肺部表达量新生和成年感染组均与对照组有显著差异(P<0.05),新生小鼠感染后9天是对照组的6倍,而成年小鼠感染后5天是对照组的16倍,感染后9天是对照组的11倍,至14天消失,说明新生小鼠感染PVM后粘液分泌的变化。
结论:
PVM感染新生和成年BALB/c小鼠均可导致肺部的炎症病理反应,成年小鼠的炎症反应比新生小鼠更强烈,类似于RSV严重感染的婴幼儿。