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大气当中的微生物与周围干燥的固体颗粒、液体小滴结合形成稳定的胶体体系,它能够随空气流动向周围扩散形成微生物气溶胶（Microbiological aerosols）。细菌和真菌是微生物气溶胶的主要组成成分,它们当中的致病或条件性致病微生物,对动物体和人体的健康构成一定程度的威胁,即使吸入高浓度的非病原微生物也会对动物体或人体产生免疫抑制。细颗粒物PM2.5（fine particles）是空气动力学直径小于等于2.5μm的微粒。PM2.5的粒径较小、表面积大,使其沉降速度变慢,传播距离增长,且能够进入到呼吸道的深部细支气管、肺泡等处,甚至通过气血交换进入到全身各处,对机体健康产生危害。PM2.5发挥其毒理学效应的基础是诱发机体氧化应激反应和炎症应答。流行病学大量研究显示,高浓度的PM2.5暴露能够诱导机体的氧化应激、炎症反应、细胞凋亡,引起呼吸系统、免疫系统、心血管系统等全身多个组织器官的损伤,使发病率和死亡率增加,甚至降低人类寿命。当前,国内外学者对于PM2.5的研究集中于对其理化性质的分析和研究以及其相应的致病机理方面,尚少见对于其中微生物成分及其作用的研究,而对于动物舍PM2.5的研究就更少了。自噬是细胞内发生物质循环的重要生理过程,对于维持细胞内环境稳态有非常重要的作用。自噬与许多疾病的发生相关,很多研究已经证明氧化应激是诱导细胞发生氧化损伤的常见途径,活性氧ROS（reactive oxygen species）是调节细胞存活和死亡过程中重要的信号分子,并且ROS可以通过不同的信号分子途径激活自噬。在此背景下,我们对鸭舍环境PM2.5进行采集,对其中的微生物成分（细菌和真菌）进行检测;为了揭示鸭舍PM2.5对动物和人体的危害,我们进行鸭舍PM2.5短期和长期暴露小鼠实验,明确其对哺乳动物肺部的病理损伤、氧化应激、细胞凋亡以及相关免疫因子表达的影响,将其对肺部的损伤进行一个全面的评估,并明确其中生物成分所起到的作用。此外,我们还进行体外实验,将PM2.5暴露于人支气管上皮细胞,对PM2.5诱导呼吸道炎性和氧化应激的分子机制进行进一步深入研究,揭示了ROS-SRC-STAT3轴在PM2.5诱导的BEAS-2B细胞自噬中起到重要作用。本研究包括以下五部分内容:1.鸭舍环境PM2.5中细菌和真菌的多样性分析本研究中鸭舍PM2.5浓度为112μg/m3-208μg/m3,大大超过我国的PM2.5标准值75μg/m3,这也意味着本研究中鸭舍的颗粒物对动物及动物舍从业人员的潜在健康威胁更大。通过16S高通量测序技术对细菌样品进行分析,五个鸭舍PM2.5共同含有的OTUs为160种,五个鸭舍A、B、C、D、E独有的OTUs分别为26、6、4、13、17,交叉性很高,表明采样鸭舍之间细菌样品组成相似性比较高。鸭舍样品在门分类水平上排名前五的物种有:Actinobacteria（放线菌）、Firmicutes（厚壁菌门）、Proteobacteria（变形菌门）、Bacteroidetes（拟杆菌门）、Patescibacteria。Actinobacteria是绝对的优势物种。在属水平上排名前10的菌种依次是:Corynebacterium-1、Corynebacterium（棒状杆菌属）、Staphylococcus（葡萄球菌）、Romboutsia、Turicibacter（杆菌属）、Vagococcus（漫游球菌属）、Macrococcus（巨型球菌）、Jeotgalicoccus、Rothia（罗斯氏菌）、Aerococcus（气球菌）。Corynebacterium-1相对丰度最高,是绝对的优势物种。丰度较高的Corynebacterium（棒状杆菌属）、Staphylococcus（葡萄球菌）、Aerococcus（气球菌）属于致病或条件致病菌,对人体健康有潜在危害。通过ITS高通量测序技术对鸭舍真菌样品进行分析,五个鸭舍PM2.5共同含有的OTUs为96种,五个鸭舍A、B、C、D、E独有的OTUs分别为8、4、1、79、14,五个样品OTUs交叉性也很高,表明采样鸭舍之间真菌样品组成相似性比较高。在真菌门水平检测到Ascomycota（子囊菌门）和Basidiomycota（担子菌门）。在属水平上排名前10的菌种依次是:Aspergillus（曲霉菌）、Cladosporium（枝孢菌）、Trametes（栓菌属）、Alternaria（链格孢属）、unclassified.p.Ascomycota、Diutina、Schizophyllum（裂褶菌）、Bjerkandera（烟管菌）、Coprinellus（鬼伞属）、Mycosphaerella（球腔菌）。其中丰度最高的是Aspergillus（曲霉菌）,属于绝对优势物种。其中丰度排名前两位的Aspergillus（曲霉菌）、Cladosporium（枝孢菌）属于致病或条件致病菌,对人体健康有潜在危害。2.PM2.5(PM2.5-,PM2.5+)单一和重复暴露BALB/c小鼠后免疫相关因子的表达及肺部损伤的研究为了评估短时间和长时间暴露于鸭舍PM2.5对于肺部病理损伤和免疫应答的影响,我们进行小鼠PM2.5暴露实验。肺组织病理学结果显示PM2.5暴露会对肺部产生不同程度的病理损伤,Masson染色显示肺部出现纤维化病变,且重复暴露组的病理变化更为明显。针对与上皮细胞-间充质转化（EMT）密切相关的E.钙黏蛋白（E-cadherin）和波形蛋白（Vimentin）双重免疫荧光显示,随着PM暴露时间的增长,上皮细胞标志蛋白E.钙黏蛋白（E-cadherin）表达量下调,间充质标志物波形蛋白的表达量上调,进一步证明肺部纤维化水平增加。针对Toll样受体的检测结果表明,TLR2、TLR4、TLR9的表达量与对照组相比显著上调,重复PM2.5+暴露组均极显著上调（P<0.01）,TLR3和TLR7的表达量没有显著的变化。这表明TLR2、TLR4、TLR9受体在识别PM成分过程中起到重要的作用,生物成分在其中的作用不容忽视。对于细胞因子的检测表明,重复暴露组TNF-α、IL-6、VEGFA的表达量与对照组相比显著上调（P<0.05）,表明它们是PM2.5暴露过程中发挥效应的主要细胞因子。总而言之,本部分试验初步确认了大气颗粒物及其微生物成分在哺乳动物的病理损伤及相关免疫应答反应的作用,为进一步研究其致病机制提供理论依据。3.PM2.5(PM2.5-,PM2.5+)单一和重复暴露BALB/c小鼠引起的肺部氧化应激和细胞凋亡的研究本部分研究评估了PM暴露以后小鼠肺组织氧化应激和细胞凋亡的影响。首先,对肺部的总抗氧化能力T-AOC、超氧化物歧化酶SOD、谷胱甘肽过氧化物酶GSH-PX、丙二醛MDA这4个主要的氧化应激指标进行测定。与对照组相比,随着PM2.5暴露时间的增长,T-AOC、SOD、GSH-PX的表达量呈下降趋势,丙二醛MDA的表达量呈上升趋势,且相同暴露时间内PM2.5+暴露组对氧化应激各指标的影响均高于PM-2.5暴露组。这表明PM暴露能够降低肺部的抗氧化能力,增加脂质过氧化作用,引起机体的氧化应激损伤。对于PM2.5暴露以后肺部细胞凋亡的研究显示,PM2.5的暴露能引起小鼠细胞凋亡率明显的升高,且重复PM2.5+暴露组细胞凋亡率最高。总之,本部分研究表明PM2.5暴露能诱导机体发生一定程度的氧化应激反应和细胞凋亡,对机体健康产生危害。4.PM2.5暴露对BEAS-2B细胞细胞存活率的研究本部分研究初步探究了PM2.5暴露对Beas-2B细胞的细胞毒理学效应。将BEAS-2B细胞进行PM2.5的时间和浓度暴露实验,结果表明PM2.5暴露使细胞的存活率以时间和剂量依赖性方式显著降低,PM2.5暴露对BEAS-2B细胞产生一定的毒理学效应。上一部分的研究显示PM2.5暴露能诱导机体产生一定的氧化应激效应,因此我们对PM2.5暴露过程中Beas-2B细胞产生的活性氧ROS进行检测,随着暴露时间的增长,ROS的产生量增多。接下来我们使用ROS的清除剂NAC（N-acetyl-L-cysteine）预处理细胞然后进行PM2.5暴露,发现NAC预处理能够一定程度缓解PM2.5对细胞存活率的影响。本部分研究结果与动物实验类似,PM2.5暴露也能够使细胞发生氧化应激反应,并对BEAS-2B细胞活力产生影响。5.PM2.5暴露对BEAS-2B细胞细胞自噬及相关信号通路的研究本部分研究针对PM2.5暴露诱导的自噬及其介导的信号通路的研究。PM2.5暴露于BEAS-2B细胞后,首先通过电镜和StubRFP-SensGFP-LC3慢病毒感染实验,明确PM2.5能够诱导BEAS-2B细胞自噬且自噬流顺畅。为了检测SRC/STAT3信号通路是否参与到鸭舍PM2.5诱导BEAS-2B细胞发生自噬的过程中。首先,通过Western Blot实验表明,PM2.5的暴露能够使SRC和STAT3的磷酸化水平呈浓度依赖性增加。对SRC干扰后进行PM2.5暴露,发现STAT3的磷酸化被抑制。当使用自噬抑制剂3-MA预处理细胞后进行PM2.5暴露,SRC、STAT3的磷酸化都能被显著抑制。以上结果表明PM2.5暴露可以通过介导SRC/STAT3通路诱导BEAS-2B细胞自噬。为了验证ROS在PM2.5暴露中的作用,使用ROS的清除剂NAC预处理细胞后进行PM2.5的暴露,表明NAC能够一定程度上影响到PM2.5对SRC/STAT3的表达。以上实验共同证明PM2.5暴露可以通过介导ROS-SRC-STAT3途径在支气管上皮细胞中诱导自噬。总之,本研究为深入探究鸭舍环境PM2.5暴露诱导肺部病理损伤的机制奠定了基础,对PM2.5致呼吸系统疾病的防治提供了新思路。