论文部分内容阅读
鸭坦布苏病毒病又名鸭产蛋下降综合征,是一种新型的急性传染性疾病。是由鸭坦布苏病毒(Duck Tembusμvirus,DTMUV)引起的,主要在产蛋鸭上引起产蛋率下降,后期出现神经症状。除感染鸭以外,还可以感染鹅,鸡,鸽,麻雀。作为蚊媒传染病的一种,鸭坦布苏病毒的传播与蚊子有关,还可通过排泄污染饮水,饲料等进行传播。该病传播迅速,影响范围广,蛋鸭感染鸭坦布苏病毒后产蛋率可由产蛋高峰(70%～90%)下降到接近10%。鸭坦布苏病毒病2010年4月在中国东南部地区首先爆发,之后在福建,山东,浙江,江苏,广西的一些水禽养殖密度最大的地区广泛流行。2011年、2012年、2014年又大面积爆发,现该病已经成为我国家禽养殖业的一种常见病,很大程度上威胁我国家禽养殖业的发展。目前对该病的治疗还没有形成商品化的疫苗,只能通过改善养殖卫生环境,做好生物安全防控,适当地进行药物预防为主。DMTUV是一种单股正链RNA病毒,属于黄病毒属(Flavivirus)恩塔亚病毒群(Ntayavirusgroup)。WNV病毒在蚊子细胞上连续传代20次,DENV2型1668株在原代狗肾细胞连续传代53次、DTMUV在小鼠颅内连续传代3次会产生大斑,小斑混合的情况,提示有发生突变。本实验发现实验室保存的鸭坦布苏病毒XZ2012株在BHK-21细胞上出现大斑和小斑混合的情况。挑斑后对不同大小噬斑准种进行全基因测序,并进行生物学特性方面的研究。研究内容分为两个方面:1鸭坦布苏病毒XZ2012株不同大小噬斑准种的分离和基因特征研究本实验室保存有2012年江苏徐州地区分离的一株鸭坦布苏病毒XZ2012株在BHK-21细胞上适应病毒,在对其进行空斑形成实验时发现,XZ2012噬斑表型为大斑和小斑混合的情况,怀疑该分离株可能存在不止一种病毒准种。在对其形成的噬斑进行挑斑准种,连续三次,得到噬斑表型稳定遗传的不同大小噬斑准种毒株。三株 DTMUV 大斑准种分别命名为 DTMUVJS-L1/2015,DTMUVJS-L2/2015,TMUV JS-L3/2015,四株 DTMUV 小斑准种分别命名为DTMUVJS-S1/2015,DTMUVJS-S2/2015,DTMUV JS-S3/2015,DTMUV JS-S4/2015。参照 NCBI 上登录的 DTMUV XZ2012株基因序列(序列号:KM188953.1)设计14对引物,对分离出的7个DTMUV准种进行全基因组测序。测序结果经MegAlign拼接后在NCBI上进行比对,结果发现与DTMUV XZ2012株相似度高达99%,但是比较大斑和小斑序列比对发现,大斑和小斑差异主要体现在XZ2012核苷酸位置1140,10699。DTMUVXZ2012株编码囊膜蛋白E基因核苷酸位置第1140位的基因突变引起E蛋白第62位氨基酸E-→A的变化,这可能是导致噬斑表型差异出现的原因。2.鸭坦布苏病毒XZ2012株大斑准种L1和小斑准种S1的生物特性分析本研究首先筛选出噬斑表型差别明显的鸭坦布苏病毒大斑L],小斑S1,并在BHK-21、Vero和DF-1细胞上进行验证,噬斑表型差别稳定存在。为找出DTMUV大斑准种L1,小斑准种S1生物学特性的差异,分别在BHK-21细胞和C6/36细胞上进行病毒生长曲线实验,结果表明在BHK-21细胞上,无论是细胞里面还是细胞上清里面,大斑L1的病毒含量都比小斑S1病毒含量高。对于C6/36细胞总体来说,大斑L1和小斑S1在C6/36细胞上病毒含量差异不大,但是在病毒生长早期,小斑毒S1增殖速度较大斑L1快,小斑准种S1 CPE出现时间较大斑准种L1早一天。为比较大小斑毒致病性差异,用大斑准种L1(PFU=7x105/mL)和小斑准种S1(PFU=7x105/mL)BHK-21细胞病毒液在SPF鸭胚上进行ELD50测定,结果显示S1 ELD50为10-4.64/0.1mL,L1ELD5510-3.88/0.1mL,说明小斑准种S1毒力强于大斑准种L1。为分析大小斑病毒免疫原性差异,对L1,S1病毒进行灭活,配伍佐剂ISA-206免疫小鼠,进行检测抗体水平测定,结果表明小斑准种S1较大斑准种L1抗原性强,能诱导更高水平的抗体。