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毛乳头(dermal papilla,DP)控制着毛囊(hair follicle)的再生和大小,被认为是毛囊生长和毛囊周期的控制中枢,使其成为研究毛囊形态发生发育机制的优良模型。但是体外培养的毛乳头细胞贴壁及迁出时间较长且效率较低影响实验效率,使其作为研究毛囊周期机制的试验材料受到限制。本试验旨在探索培养毛乳头细胞最适培养基及最适血清添加比例,以此来提高其培养效率。结果如下:(1)通过显微解剖法剥离陕北白绒山羊生长期初级毛囊毛乳头并进行体外原代培养,利用细胞免疫荧光染色的方法检测毛乳头细胞中CD133、α-平滑肌激动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA),结果证实所培养的细胞为毛乳头细胞。在常规培养DMEM/F12(dulbecco’s modified eagle media/nutrient mixture F-12)(1∶1)与DMEM/F-12 GlutaMAX、减血清培养基Advanced DMEM/F-12与Advanced RPMI 1640(roswell park memorial institute(RPMI)1640),四种培养基加入不同比例的血清后均可以成功培养毛乳头细胞并传代;(2)采用细胞计数、MTT、碱性磷酸酶的测定等方法证明体外培养毛乳头细胞的四种培养基添加的血清比例越高,细胞的生长、增殖速度越快,迁移、诱导能力越强。当添加10%血清时,减血清培养基培养的毛乳头细的生长增殖速率及生物学功能皆明显高于常规培养基(P<0.05)。添加6%血清的减血清培养基与添加10%血清的常规培养基的培养效果一样(P<0.05)。由此可知,减血清培养基中含有的对毛乳头细胞生长增殖、诱导能力维持或加强的有效因子相较于常规培养基,更适合于毛乳头细胞的培养。因此,建议使用血清用量较少且培养效果较好的减血清培养基体外培养毛乳头细胞。糖原合成酶激酶-3β(glycogen synthase kinase,GSK-3β)抑制剂6-溴靛玉红-3-肟(6-bromoindirubin-3-oxime,BIO)能够激活Wnt信号通路,是否可以通过BIO增强毛乳头诱导能力的基因表达还有待探索。本试验结果如下:(1)利用添加不同浓度梯度BIO的培养基体外培养毛乳头细胞,采用CCK8(cell counting kit-8)比色法结果为添加BIO的浓度越高细胞增殖能力越低,而碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,AKP)测定方法得出添加浓度为1.5μM的BIO,毛乳头细胞的诱导活力明显增强的结论;(2)以β-肌动蛋白(β-actin)为内参基因,不添加BIO培养的毛乳头细胞为对照组,利用实时荧光定量PCR与蛋白免疫印迹法验证得到:添加1.5μM BIO培养的毛乳头细胞胰岛素样生长因子1基因(insulin like growth factor 1,IGF-1)、AKP、成纤维细胞生长因子受体7基因(fibroblast growth factor receptor 7,FGF7)、β-链蛋白(β-catenin)的表达量均显著上调(P<0.05),而骨形态发生蛋白4基因(bone morphogenetic protein 4,BMP4)表达量显著下调(P<0.05)。本研究首次探索出较适宜陕北白绒山羊毛乳头细胞体外培养的最佳培养基类型及血清浓度,并探究出1.5μM BIO对维持离体毛囊DP细胞诱导活性有重要作用,为进一步研究毛乳头调控毛囊周期发育的分子机制提供了理想细胞模型。