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近年来,H5Nx禽流感病毒遗传进化迅速,不断通过基因突变和基因重排产生新的亚型,严重威胁家禽养殖业和人类健康,对H5亚型禽流感的防控带来新的挑战。野生动物在H5Nx禽流感病毒的进化、流行与传播过程中扮演了重要角色。一方面,野鸟是禽流感病毒的天然储存库,禽流感病毒可随候鸟在全球范围内长距离迁徙而获得与各地区流行病毒重组和重配的机会。另一方面,致死性H5N1禽流感病毒跨种传播至果子狸、虎、狮等野生哺乳动物,威胁野生哺乳动物的生命安全和生物多样性。监测H5Nx流感病毒野生动物中的流行趋势,解析野生动物携带H5Nx流感病毒的遗传进化规律及其对家禽、哺乳动物致病性和传染性改变趋势,对于及时进行H5Nx禽流感病毒流行预警、评价野生动物携带的H5Nx流感病毒有无跨种传播风险至关重要。本研究通过对野鸟及野生哺乳动物感染H5Nx禽流感病毒进行主动预警监测和紧急疫情检测明晰了野生动物携带H5Nx禽流感病毒情况;利用病毒全基因组测序、系统发育及关键氨基酸位点分析解析了野生动物源H5Nx禽流感病毒遗传进化情况,进而通过体外和体内复制动力学、受体结合特性检测、豚鼠间传播实验等方法,评价了不同野生动物源H5Nx禽流感病毒致病性与传播能力。首先,本研究进行了野鸟及野生哺乳动物的主动预警监测和紧急疫情检测。2015年8月份至2017年5月份,选取候鸟迁徙路线上重要的繁殖与停歇地作为野鸟样品采集点,采集咽拭子、肛拭子、粪便等样品共计9082份,分离获得不同亚型的低致病性禽流感病毒53株,包括:H3N8(7株)、H4N6(12株)、H9N2(8株)、H6N5(6株)H7N8(14株)、H10N4(1株),H10N7(4株)、H12N5(1株),未分离到H5亚型禽流感病毒。在紧急疫情检测方面,本研究从死亡野鸟体内分离获得3株clade 2.3.4.4 H5N6及H5N8亚型禽流感病毒,从死亡东北虎及狮子体内分离到3株clade 2.3.2.1c H5N1亚型禽流感病毒,继而对分离到的H5Nx AIVs毒株进行系统发育分析,明确了其遗传进化情况,并对决定其相关生物学特性的关键氨基酸位点进行分析,发现不同谱系野生动物源H5Nx禽流感病毒重配情况复杂,既存在H5亚型之间的重配,又存于低致病禽流感病毒的重配。氨基酸突变位点分析显示H5Nx分离株不同程度携带哺乳动物致病性增强的氨基酸突变位点。在上述研究的基础上,将虎源H5N1、狮源H5N1、野鸟源H5N8(斑头雁)、H5N6(孔雀)亚型禽流感病毒野毒株分别感染MDCK细胞和BALB/c小鼠,评价与分析野生动物源H5Nx分离株的体内外复制能力、组织嗜性、小鼠半数致死量、受体结合能力、致病性及传播能力。实验结果表明,clade 2.3.2.1c H5N1禽流感病毒在体内外表现出更强复制能力,对小鼠具有广泛的组织嗜性及高度致病性。Clade2.3.4.4野鸟源H5亚型禽流感病毒可以不经适应直接感染小鼠并在呼吸系统内复制,其中野鸟源H5N8对小鼠呈低致病性,野鸟源H5N6对小鼠呈中度致病性。与野生哺乳动物源clade 2.3.2.1c H5N1禽流感病毒相比,其在体内外复制能力较低,表现出有限的组织嗜性;保持结合禽样受体的能力,且不能在豚鼠间传播。综上所述,本研究加深了对野生动物携带H5Nx禽流感病毒的认识和理解,对野生动物源H5Nx禽流感病毒生物学特性的评价,为预测野生动物源H5Nx禽流感病毒遗传进化趋势及其生物安全风险评估提供借鉴和参考。