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目的 巨噬细胞金属弹力酶(mouse macrophage metalloelastase,MME)是基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)家族成员之一,也称MMP-12。与其它MMP成员不同,MME可以分解纤溶酶原,产生具有抑制血管内皮细胞增殖作用的血管抑素(angiostatin),进而抑制体内肿瘤细胞的生长,在抗肿瘤血管生成中具有重要作用。本研究主要探讨小鼠巨噬细胞金属弹力酶对小鼠原位结肠癌生长、微血管生成及血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)表达的影响。 方法 PCR扩增编码MME基因结构域Ⅰ和Ⅱ的cDNA片段,克隆入pGEM-T载体中,限制性内切酶、DNA序列分析鉴定目的基因后,定向亚克隆到真核细胞表达载体pcDNA3.1(+)中,并进行双酶切及PCR鉴定。再将构建的真核细胞表达载体pcDNA3.1-MME稳定转染小鼠CT-26结肠癌细胞。采用RT-PCR、免疫细胞化学和Western blot方法,鉴定MME mRNA和重组蛋白在CT-26细胞中的表达。采用体外分解Ⅰ型胶原蛋白和明胶酶谱方法,鉴定MME重组蛋白的酶活性。建立MME转染组及对照组小鼠原位结肠癌种植模型,观察MME对原发性结肠癌生长的影响,采用免疫组织化学、原位杂交及Western blot方法检测肿瘤组织中微血管密度(microvessel density,MVD)和VEGF的表达。 结果 以重组质粒pUC9-MME cDNA为模板进行PCR扩增,PCR产物经纯化后,在1%琼脂糖凝胶电泳中可见一条清晰的条带,位于750bp和1000bp之间,与预期的840bp目的基因片段长度相符。pGEM-T-MME用BamHI和XbaI双酶切,产生2个大小分别为3.0kb和832bp左右的条带,与预期结果基本一致。pGEM-T-MME核苷酸序列正向测序和反向测序结果表明,与小鼠MME cDNA序列的碱基符合率为99.63%。pcDNA3.1(+)-MME重组质粒用BamHI和XbaI双酶切,可见2条分别