在植物花粉发育过程中,大量基因参与小孢子发育、花粉壁构建、有丝分裂、减数分裂、花粉填充物合成等活动,这些基因高度有序的表达是获得可育花粉的必要条件和重要保证,基因突变或者环境条件改变都有可能影响花粉发育,甚至引起雄性不育。为研究白菜(Brassica campestris L.ssp.chinenesis Makino,syn.B.rapa ssp.chinenesis)Polima核质互作雄性不育系’Bcpol97-05A’、Ogura细胞质雄性不育系‘Bcogu97-06A’与其共同的保持系’Bcajh97-01B’蕾期基因表达差异,我们采用cDNA-AFLP技术和ATHl GeneChip研究三个材料蕾期基因的表达情况,分析并揭示在相同核背景下两胞质不育材料蕾期基因表达的异同,为花粉发育和植物雄性不育提供分子依据。在此基础上,我们利用RACEs(rapid amplification of cDNA ends)利同源克隆等方法从‘矮脚黄’白菜及近缘十字花科植物中克隆了一些重要基因。(1)利用cDNA-AFLP技术分析’Bcpo197-05A’、‘Bcogu97-06A’与’Bcajh97-01B’蕾期基因表达差异,获得了98条511性差异转录片段(transcript-derived fragments,TDFs),在‘Bcpol97-05A’与‘Bcajh97-OIB’花蕾特异表达61条,‘Bcpol97-05A’花蕾中特异沉默30条,‘Bcp0197-05A’花蕾特异表达的12条。‘Bcogu97-06A’与’Bcajh97-01B’花蕾存在差异TDFs有75条,其中在’Bcogu97-06A’花蕾中特异沉默的40条,‘Bcogu97-06A’花蕾特异表达的8条。98条阳性TDFs中,21条在保持系’Bcajh97-01B’中特异表达,4条仅在’Bcogu97-06A’花蕾中特异表达,8条仅在’Bcpol97-05A’花蕾中表达。这些TDFs代表的基因涉及细胞壁合成与调控、防卫与胁迫反应、电子传递和能量途径、普通新陈代谢、蛋白质代谢、信号转导、转录调控和转运通道等方面。(2)利用拟南芥Affymetrix全基因组芯片ATHl GeneChip研究’Bcpol97-05A’、‘Bcogu97-06A’和’Bcajh97-01B’蕾期基因表达差异,共得到688个差异表达基因,338个基因在两不育系中上调,352个基因在两不育系中下调。在上调基因中,63个基因为两不育系所共有,其中有大量的叶绿体、线粒体基因参与上调表达,‘Bcpol97-05A’材料特有的上调基因有94个,其中24个为叶绿体或线粒体基因,‘Bcogu97-06A’材料中特异上调基冈有116个,其中4个为叶绿体和线粒体基因:在338个下调基冈中,75个基因在两不育系中共同下调,在’Bcpol97-05A’中下调的基因有93个,‘Bcogu97-06A’材料中下调的基因有109个。借助拟南芥Affymetrix全基因组基因芯片,获得了比cDNA-AFLP技术更为丰富的差异表达信息。(3)以‘Bpol97-05A’和‘Bajh97-01B’为材料,根据cDNA-AFLP技术获得一条长约330 bp的特异序列P1708,RT-PCR验证确认该序列仅在不育白菜材料中表达,经测序和BLAST比对,发现该片段与叶绿体trnL和ndhJ基冈之间的一段序列完全一致,并有54 bp的重复序列。根据trnL和ndhJ基因两端的保守序列设计全和长引物,分别以不育白菜及其原保持系的cDNA为模板,获得了长约2,000 bp的序列,该序列包含trnL、trnF和ndhJ等三个基因的完整序列,比对两序列发现:不育白菜‘Bpol97-05A’中除108 bp的插入序列外,另有多个位点发生变异。(4)富含脯氨酸蛋白(proline-rich protein,PRP)是构成细胞壁的一类重要结构蛋白,在花粉发育过程中,也同样需要这类蛋白。根据cDNA-AFLP获得的差异表达片段B0610,利用RACEs技术住‘Bajh97-05B’中克隆到了基因全长,定名为白菜花药特异富含脯氨酸蛋白(Brassica campestmsAnther-specific Proline-rieh Protein,BcAPG)基因。基因编码区长1,731 bp,编码576个氩基酸,推导的蛋白质序列中,脯氨酸残基含量极高,占总氨基酸数量的22.4%。另外,我们从6种十字花科植物中克隆到了它的同源基因,所推导的氨基酸与NCBI中己知的PRP相比,序列存在较大差异,推测这些基因产物属于一类新的PRP。RT-PCR结果表明,该基因仅在可育的Ⅲ级、Ⅳ级和Ⅴ级花蕾中表达,其它各级花蕾及营养器官中均朱检测到,而且,在两个不育系中的所有花蕾均未见表达。进一步实验表明,仅在花约中检测到BcAPG的表达,而花丝、花瓣、花梓和花萼中均未见表达,推测可能在白菜花粉壁的构建中起着重要作用。(5)拟南芥MS2与雄性不育密切相关,基因芯片数据分析表明,三个白菜材料在MS2探针上存在差异,保持系’Bajh97-01B’中检测到较强的杂交信号,而两个不育系中信号缺失。利用同源克隆技术,分别从‘Bajh97-01B’叶片基因组DNA和混合花蕾cDNA中克隆到了MS2同源基因的DNA和cDNA全长,命名为白菜雄性不育2(Brassica campestris Male Sterility 2,BcMS2)基因。BcMS2的DNA全长为2,576bp,具8个外显子和7个内含子,编码区长1,851 bp,编码616个氨基酸,蛋白质C端含有一个微体目标信号序列Gla-Arg-Ala,该蛋白位点与微体特异结合。RT-PCR结果显示,BcMS2仅在可育材料的Ⅲ级花蕾中表达,其它各级花蕾及营养器官中均未能检测到,在两不育材料的所有部位都没有表达,进一步研究表明,BcMS2的表达具有花药特异性。(6)肌动蛋白是细胞骨架微丝系统的重要组成部分,在花粉发育及花粉管伸长过稗中,肌动蛋白的活动十分活跃,是花粉可育和花粉管顺利生长的重要保证。根据已知序列,设计全长引物,从混合花蕾cDNA和叶片基因组DNA中克隆到了各自的全长,基冈命名为BcACT(Brassica campestrisActin)基因。其DNA全长为1,704 bp,具3个内含子,编码区长度为1,134 bp,编码377个氨基酸。基因表达结果显示,BcACT基冈在保持系‘Bajh97-05B’和Polima不育系‘Bpol97-05A’的花蕾中表达,但表达模式存在差异,而在Ogura不育系‘Bogu97-06A’未见表达。此外,BcACT基冈的表达具有花药特异性,随着花约的成熟,表达量逐渐增加。(7)根据基因数据库已有的拟南芥profilin4及其同源基因设计简并引物,住白菜花蕾cDNA中成功克隆到前纤维蛋白基因,命名为白菜前纤维蛋白(Brassica campestrisProfilin,BcPRO)基因,基因库中的登陆号为EF492988。BcPRO编码区由405个核苷酸组成,编码134个氨基酸,推导的氨基酸序列与甘蓝型油菜和拟南芥的花粉前纤维蛋白分别有95%和92%的同源性。RT-PCR表明,BcPRO仅在保持系的Ⅲ级、Ⅳ级和Ⅴ级花蕾及Polima雄性不育系的Ⅲ级和Ⅳ级花蕾中表达,并且表达量逐级增大,而在莲座叶、花茎叶、茎、根及Ogura雄性不育系的所有部位均未能检测到。进一步研究发现,BcPRO在花药中表达,在萼片、花丝、雌蕊、花瓣等部位均未见表达。这些实验结果表明,BcPRO为花药特异基因,可能在发粉发育过程中起着重要的作用,并且在相同核背景下,有着不同的核-质互作模式。(8)基因芯片研究白菜材料蕾期基冈表达差异时,发现拟南芥的一个查尔酮合成酶基因探针的杂交信号有显著差异,保持系‘Bcajh97-01B’和Ogura细胞质雄性不育系‘Bcogu97-06A’有较强的杂交信号,而Polima核质互作不育系中没有检测到相应信号。根据基因数据库中已发布的拟南芥及其同源基因序列,设计了全长扩增引物,成功克隆出该基因,命名为白菜查尔酮合成酶(Brassica campestrisChalcone Synthase,BcCHS)基因。该基因在NCBI基因数据库中的登陆号为EF101136。BcCHS基因的编码区全长为1,188 bp,编码395个氨基酸,基因组DNA全长为1,263 bp,具一个长75 bp的内含子。BcCHS在保持系‘Bcajh97-01B’和Ogura细胞质雄性不育系‘Bcogu97-06A’的Ⅳ级、Ⅴ级花蕾及开放的花朵中表达,进一步研究表明,BcCHS在花药和花瓣中表达,在花朵的其它部位没能检测到。此外,在白菜白花突变体基因组DNA中克隆到BcCHS-wf,该基因与野生型白菜BcCHS基因相比,发现了两个突变位点,在推导的氨基酸序列中,相应位置编码精氨酸的AGA和编码丝氨酸的AGC均替换成了甘氨酸。