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染料木素(genistein,Gen)是大豆异黄酮的主要活性成份。Gen作为植物雌激素,与雌激素相比,在发挥神经保护作用的同时没有对非神经细胞的致癌等副作用。Gen的神经保护作用受到持续关注。我们前期的研究发现,Gen可增强PKC的活性,调节α-/β-分泌酶活性,减少不溶性Aβ沉积,并逆转Aβ诱导的Bcl-2的下调和Bax的上调,降低细胞的凋亡程度,最终显著提高Aβ刺激的PC12细胞的活力。目前,有关Gen的神经保护效应及其机制逐渐深入,但其分子保护机制及其相关的信号仍有待进一步阐明。本论文继续探讨Gen体外水平的抗Aβ神经保护机制及其分子机制。具体内容如下:1.Gen对Aβ诱导PC12细胞损伤的细胞活力、凋亡染色、凋亡率的研究:MTT细胞活力测定结果显示,0-25μM的Gen对细胞活力几无影响,而50和100μM Gen使细胞存活率显著降低,Aβ显著降低PC12细胞存活率的最小剂量是20μM,0-100μM的Gen都显著提高Aβ处理的PC12细胞存活率,而25μM的Gen具有最大保护效应;Hoechst 33342凋亡染色结果表明,与对照组相比,Aβ诱导的PC12细胞有明显的凋亡细胞特征,其凋亡细胞比例显著多于对照组,而Gen处理组(12.5、25、50和100μM)显著减少凋亡细胞的比例;Annexin V-FITC双染法检测细胞凋亡率结果显示,Aβ组显著高于对照组,且Gen作用组(12.5、25、50和100μM)都显著抑制Aβ诱导的细胞凋亡,但25μM剂量的Gen具有最大抑制效应。2.q PCR和Western blot检测Gen对Aβ诱导PC12细胞Fas和Fas L m RNA和蛋白表达的影响:q PCR结果显示,Aβ诱导组显著增加Fas L的表达,温和上调Fas的表达,Gen显著抑制Aβ诱导的Fas和Fas L m RNA的增加;Westernblot结果显示,Aβ组显著增加Fas和Fas L的表达,Gen显著抑制Aβ诱导的Fas和Fas L蛋白水平的增加。3.q PCR和Western blot检测Gen对Aβ诱导PC12细胞Bcl-w和Bim m RNA和蛋白表达的影响:q PCR结果显示,Aβ组显著减少Bcl-w和增加Bim的表达,Gen可逆转Aβ诱导的Bcl-w和Bim的变化;Western blot结果与q PCR结果一致。4.Western blot检测Gen对Aβ诱导PC12细胞质中Cyt C和Smac蛋白表达的影响:结果显示,Gen可逆转Aβ刺激引起Cyt C和Smac从线粒体到细胞质的释放。5.q PCR和分光光度法检测Gen对Aβ诱导PC12细胞Caspase-3和Caspase-8 m RNA和酶活力的影响:结果显示,Gen可抑制Aβ诱导Caspase-3和Caspase-8 m RNA的增加;Caspase-3和Caspase-8酶活性测定进一步证实了Gen对Aβ诱导细胞Caspase-3和Caspase-8的抑制作用。6.采用JNK-si RNA和磷酸化抑制剂SP600125干扰JNK,检测Aβ诱导PC12细胞Fas和Fas L m RNA和蛋白表达的变化:结果表明,Gen、JNK-si RNA和SP600125均对Aβ刺激引起的Fas和Fas L m RNA和蛋白水平表达有抑制作用,Gen与JNK-si RNA/SP600125合用效果最强。7.采用JNK-si RNA和磷酸化抑制剂SP600125干扰JNK,检测Aβ诱导PC12细胞Bcl-w和Bim m RNA和蛋白表达的变化:结果表明,Gen、JNK-si RNA和SP600125均对Aβ刺激引起的Bcl-w和Bim m RNA和蛋白水平表达有抑制作用,Gen与JNK-si RNA/SP600125合用效果最强。8.采用JNK-si RNA和磷酸化抑制剂SP600125干扰JNK,检测Aβ诱导PC12细胞质中Cyt C和Smac蛋白表达的变化:结果表明,Gen、JNK-si RNA和SP600125均对Aβ刺激引起的Cyt C和Smac蛋白表达有抑制作用,Gen与JNK-si RNA/SP600125合用效果最强。9.采用JNK-si RNA和磷酸化抑制剂SP600125干扰JNK,检测Gen对Aβ诱导PC12细胞Caspase-3和Caspase-8 m RNA和酶活力的影响:结果表明,Gen、JNK-si RNA和SP600125均对Aβ刺激引起的Caspase-3和Caspase-8 m RNA和酶活力有抑制作用,Gen与JNK-si RNA/SP600125合用效果最强。10.Westernblot检测Gen对Aβ诱导PC12细胞p-JNK和JNK蛋白表达的影响:结果表明,Aβ显著诱导PC12细胞p-JNK 54和46 k Da条带,而Gen可显著减弱p-JNK 54和46 k Da条带,Gen+SP600125合用效果最强。研究结果表明,JNK-si RNA和SP600125均对Aβ刺激引起Fas介导凋亡途径和线粒体凋亡途径有抑制作用,暗示JNK参与调节Aβ诱导PC12细胞Fas介导的和线粒体起始的凋亡途径,而Gen显著抑制Aβ诱导的JNK磷酸化的结果表明,Gen可能通过对Aβ诱导的JNK依赖的Fas和线粒体凋亡通路的抑制,从而抑制Aβ诱导的PC12细胞凋亡,发挥神经保护作用。然而,Gen与JNK-si RNA或JNK抑制剂SP600125合用组的结果表明,Gen针对Aβ诱导的Fas和线粒体凋亡通路的抗凋亡效应可能只是Gen多靶点抗凋亡效应的其中之一,其神经保护机制有待进一步被阐明。