论文部分内容阅读
目的: 为了探索长链非编码RNA(lncRNA)前列腺癌相关性转录本1(PCAT-1)在肝癌侵袭转移的机制,我们检测了PCAT-1在肝癌组织及细胞株中的表达差异,并探讨其与肝癌临床分期,病理分级之间的关系。检测PCAT-1沉默对肝癌细胞侵袭迁移能力的影响。通过构建PCAT-1和HMGB1荧光素酶载体,探索PCAT-1是否能够作为竞争性内源性RNA(ceRNA)抑制miR-129-5p的功能,从而提高miR-129-5p的靶基因HMGB1的表达。而这种lncRNA-miRNA-mRNA提高了我们对肝癌侵袭转移机制的认识,PCAT-1-miR-129-5p-HMGB1通路也将为肝癌的诊断及治疗提供了新的思路。 方法: 收集2012.08-2016.04期间在南昌大学第二附属医院肝胆外科行肝部分切除术(术前未放疗或化疗),术后确诊为肝细胞肝癌患者的肝癌组织和相应的癌旁正常肝脏组织,整理患者的临床病理资料。选用Trizol法提取总RNA,定量后逆转录成cDNA,利用实时荧光定量PCR(Quantitative real-time PCR,qPCR)检测肝癌组织、癌旁组织及肝癌细胞株中的PCAT-1的表达,并结合统计学方法进行分析。在体外实验中,①构建siRNA载体,研究PCAT-1沉默对肝癌细胞株HepG2和LM3迁移及侵袭能力影响。划痕实验检测细胞迁移,transwell实验检测细胞迁移和侵袭。②结合生物信息学数据库miRcode,UCSC,TargetScan提供的信息,构建PCAT-1和HMGB1的荧光质粒,运用荧光素酶报告实验检测PCAT-1-miR-129-5p和HMGB1-miR-129-5p的关系。③研究PCAT-1沉默对miR-129-5p表达的影响,研究PCAT-1沉默对HMGB1的表达的影响。免疫组化及Western blot检测HMGB1蛋白表达水平的改变。 结果: 1、LncRNA PCAT-1在人肝细胞肝癌组织中的表达量显著高于相应的癌旁肝组织中的表达量(P<0.001)。肝细胞肝癌中的表达水平和肝内转移及BCLC分期密切相关,各组之间存在显著差异(P<0.05)而与其他临床指标,如年龄、性别、AFP等无统计学差异(P>0.05)。 2、PCAT-1在肝癌细胞株HepG2和LM3的表达量也明显高于正常胎肝细胞株L02(P<0.05)。沉默lncRNA PCAT-1后,HepG2和LM3的迁移和侵袭能力明显降低。与此同时,miR-129-5p表达水平上升(P<0.05),HMGB1mRNA和蛋白水平下调(P<0.01)。 3、荧光素酶报告实验显示,PCAT-1与miR-129-5p竞争性抑制(P<0.05),HMGB1与miR-129-5p竞争性抑制(P<0.05),结合生物信息学数据库及之前的研究证实,PCAT-1能够作为ceRNA,通过PCAT-1-miR-129-5p-HMGB1通路参与肝癌的侵袭转移。 结论: 1、在肝癌组织中,上调的PCAT-1促进肝癌的侵袭转移; 2、PCAT-1的表达水平与肝癌的临床分期及侵袭转移呈正相关 3、体外细胞实验发现,沉默PCAT-1表达后,能够有效的抑制肝癌细胞株HepG2和LM3的侵袭迁移能力。且miR-129-5p表达上调,HMGB1的mRNA及蛋白水平都下调。 4、lncRNA PCAT-1在肝细胞肝癌中发挥ceRNA的作用,通过PCAT-1-miR-129-5p-HMGB1通路促进肝癌侵袭转移,提高了我们对肝癌侵袭转移机制认识,为肝癌的诊断及治疗提供了新的思路。