论文部分内容阅读
目的检测骨髓来源内皮祖细胞与骨髓基质细胞联合移植到股骨头缺血坏死部位促进坏死区局部成骨和成血管能力。方法1、密度梯度离心法分离培养兔骨髓基质细胞并进行鉴定。2、采用相同方法获取兔内皮祖细胞并进行鉴定。3、共培养的兔骨髓基质细胞与内皮祖细胞之间最佳比例采用碱性磷酸酶活性检测以确定。4、Real-Time PCR检测细胞成骨及成血管相关基因的表达。5、采用激素方法构建兔ANFH模型并进行检测。6、实验分4组:A组:空白对照B组:单独植入骨髓基质细胞悬液C组:单独植入内皮祖细胞细胞悬液D组:植入骨髓基质细胞和内皮祖细胞混合的细胞悬液7、移植用细胞悬液的制备。8、根据组别将不同种类细胞移植到兔ANFH部位。9、股骨头坏死区域检测。(1)HE染色检测植入细胞后ANFH修复情况(2)免疫组化染色检测植入细胞后ANFH模型BMP-2表达(3)CD34免疫组化检测植入细胞后ANFH模型新生血管结果1、兔骨髓基质细胞鉴定(1)镜下可见刚培养1d的细胞由于贴壁数目较少而呈现出圆形,细胞的体积较小。6d后可以观察到大部分细胞已经贴壁,细胞形态由之前的圆形变为梭形。接种9d后可以观察到细胞的数目明显较之前增多,细胞之间排列规律并且有融合的趋势。传代后的细胞形态更加单一,可见细胞铺满瓶底,旋涡状融合生长,排列有规则。(2)HE染色镜下可见,细胞出现长的梭型,生长旺盛,可见有核分裂出现。(3)第21d进行茜素红染色,可见骨髓基质细胞聚集,形成明显钙结节结构。(4)流式细胞仪结果显示,粘附分子CD44(97.85±1.56)%和受体分子CD90(96.83±1.83)%在骨髓基质细胞中高表达。而造血干细胞标记物CD34分子(5.63±2.21)%表达水平低。2、兔内皮祖细胞鉴定(1)刚刚接种的细胞生长缓慢,经过2d之后逐渐开始贴壁生长。随着培养的进行,于第9d左右细胞形态开始变成梭形或平行排列,经过15d的培养,这细胞开始出现特有的“铺路石”样子的外观。(2)内皮祖细胞能够结合FITC-UEA-1以及Di L-ac-LDL,并出现绿色以及红色荧光,双重染色阳性为内皮祖细胞。(3)造血干细胞标记物CD34分子(81.35±3.52)%、CD133分子(85.64±2.44)%在兔内皮祖细胞中表达水平较高。3、骨髓基质细胞与内皮祖细胞以1:1比例共培养时碱性磷酸酶活性最高,故选择共培养比例为1:1进行后续实验。4、细胞成骨及成血管相关基因的表达情况Real-Time PCR结果显示,共培养细胞组成骨基因表达于第7d明显高于单独骨髓基质细胞组(P<0.05)并且成血管相关基因表达在第7d高于单独内皮祖细胞组(P<0.05)。5、股骨头坏死模型构建相关检测激素法股骨头坏死模型构建后第42d,股骨头内部出现低密度影像学改变,已经出现坏死性变化。于第42d行组织学HE染色检查显示成骨细胞等组织细胞减少,骨小梁被严重破坏,骨细胞脂肪变,出现骨陷凹空虚。6、HE染色检测植入细胞后ANFH修复情况细胞植入后第8周HE染色:A组对照组尚未见到类似骨组织结构,血管生成亦少见;B组镜下可见类骨质结构,呈岛状或者条索状结构,有成骨细胞样细胞聚集;C组可见较多纤维组织以及血管生成,类骨质样结构少见;D组可见类骨质结构,并且可见密集的血管结构。7、免疫组化染色检测植入细胞后ANFH模型BMP-2表达BMP2在细胞的胞浆中表达,阳性细胞胞浆可见棕黄色颗粒。B组、C组及D组表达量高于对照组A组;其中,B组及D组BMP-2表达量高于C组(P<0.05);D组高于B组(P<0.05)。8、CD34免疫组化染色检测ANFH模型新生血管血管内皮标记物CD34检测新生血管情况:四组均可见新生血管,其中,C组及D组血管数目高于B组及A组(P<0.05);D组数目高于C组(P<0.05)。结论1、内皮祖细胞能够增强骨髓基质细胞成骨和成血管潜能。2、以1∶1比例联合移植内皮祖细胞及骨髓基质细胞到股骨头坏死局部具有很强的成骨以及成血管能力。