茶尺蠖核型多角体病毒(Ectropis obliqua nucleopolyhedrovirus,简称EoNPV),属杆状病毒科,核型多角体病毒属,对茶尺蠖具有较强的致病能力,是茶尺蠖重要的病原微生物。因此,EoNPV作为一种高效病毒生物杀虫剂已广泛应用于浙江省及周边省区茶园。EoNPV制剂是已经获批在茶园中使用的病毒药剂。但目前EoNPV制剂主要是通过镜检病毒原液中多角体粒子的含量来确定,而其防治效果的评价则依赖传统生物测定,其定性和定量检测方法较为粗放,结果可重复性不高,且耗时较长,对病毒制剂的加工及使用过程不能有效监测,在一定程度上阻碍了茶尺蠖病毒制剂的推广应用。本研究借助分子生物学与免疫学技术,包括荧光定量PCR和单克隆抗体制备,建立准确定性、精确定量的EoNPV多元化检测技术,为茶尺蠖病毒产品的检测和进一步研究提供简便、快速、稳定可靠的方法。1.p10、vp39基因原核表达及单克隆抗体的制备以茶尺蠖核型多角体病毒的基因组作为模板,通过PCR方法克隆p10、vp39基因片段。将该片段克隆连接至pGEX-4T-2载体中,构建了原核表达载体pGEX-4T-2-p10和pGEX-4T-2-vp39,再转化至大肠杆菌BL21中进行表达。将回收的P10、VP39蛋白伺时免疫小鼠,然后将小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞进行了融合,通过间接ELISA检测筛选,我们获得了3E12细胞株。该细胞株能稳定地分泌抗体,而且产生的抗体对p10蛋白和EoNPV病毒粒子均有反应,对vp39蛋白无反应,但该抗体效价低,不足以满足EoNPV检测应用。2.EoPV多角体蛋白单克隆抗体的制备以纯化后的茶尺蠖核型多角体病毒作为抗原,免疫BALB/c小鼠,将小鼠脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细胞Sp2/0融合,经间接ELISA筛选及克隆得到了一株稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株,命名为7D3。将该细胞株扩大培养,并制备腹水,通过间接ELISA检测小鼠腹水效价105。Western-blot结果显示所获得的单抗可能是一种多角体蛋白(PH)单抗。为了确认获得的单抗是一种多角体蛋白单抗,我们进一步克隆表达多角体蛋白基因,构建了表达载体质粒pGEX-4T2-ph,获得EoNPV多角体蛋白,经Western-blot鉴定,该抗体可与EoNPV的多角体蛋-白特异性结合,表明已成功制备的单克隆抗体是EoNPV多角体蛋白的单克隆抗体,这为建立定性检测EoNPV方法奠定了基础。3.EoNPV荧光定量PCR检测方法的建立根据EoNPV的基因序列设计一对引物,并从感染该病毒的虫体中提取EoNPV基因组DNA,进行PCR扩增,将该基因片段与载体pMD18-T连接,转化入大肠杆菌TG1中,经单克隆菌落筛选及测序鉴定后得到重组质粒,以该质粒为荧光定量PCR标准品模板稀释后建立标准曲线。构建的标准曲线相关系数为0.989,检测范围为103-108copies/μL,特异性和重复性较好。该方法可以准确地判断出病毒拷贝数,可为茶尺蠖核型多角体病毒在虫体内增殖动态的研究和病毒制剂的质量检测提供了方法依据。