海洋的生态环境与陆地不同，具有高盐、高压力、低温和温度变化缓慢的特点。因此，来源于海洋微生物的酶往往具有特殊的酶学性质，例如作用温度低以及对大多数金属离子耐受等，具有很高的应用价值。β-半乳糖苷酶是其中一种值得开发的酶。本研究的目的即是对海洋微生物所产的低温β-半乳糖苷酶进行研究，其主要研究方法和实验结果如下：　　 一、产β-半乳糖苷酶菌株筛选　　 采用含0.004％X-Gal和2％乳糖的Zobell2216E平板培养基进行初筛，对本实验室保存的海洋微生物菌株进行了β-半乳糖苷酶的筛选，共获得31株初筛阳性菌株。再通过TLC和HPLC进行复筛，最后选定菌株Halomonassp.S62为深入研究对象。　　 二、Halomonassp.S62产β-半乳糖苷酶的纯化及重组酶的获取　　 将Halomonassp.S62进行发酵，超声破菌，得到粗酶液后再经PABTG亲和柱、硫酸铵分段盐析、CaptoDEAE弱阴离子交换柱、CaptoQ强阴离子交换柱和SephacrylS200分子筛纯化后，获得电泳纯的BGalH蛋白，纯化倍数为1007.7倍，活性得率为1.389％。SDS-PAGE显示分子量为48kDa，Native-PAGE显示分子量为90kDa左右，推测天然BGalH蛋白为二聚体。　　 通过全基因组测序及生物信息学分析获得Halomonassp.S62的BGalH基因序列，再设计引物，PCR验证后将BGalH基因序列提交Genbank，获得登录号为JQ337961。BGalH基因的ORF为1170bp，Genbank中与之序列相似度最高的为67％(GenBankAccessionNo.CP002881.1)。　　 分别以pET32a(+)和pSP72为载体，通过分子克隆方法，构建得到重组质粒pET32a(+)-BGalH和pSP72-BGalH，用pSP72-BGalH验证了BGalH的功能后，再采用pET32a(+)-BGalH重组载体转化入大肠杆菌E.coliBL21，用IPTG诱导转化菌大量表达重组BGalH蛋白(rBGalH)，再采用Ni2+-NTA亲合层析和CaptoDEAE弱阴离子交换层析进行纯化，获得电泳纯的rBGalH，纯化倍数为146.24倍，活性得率为53.23％。SDS-PAGE显示rBGalH的分子量为63kDa，Native-PAGE和凝胶层析证实rBGalH的分子量为130kDa左右，说明，rBGalH的活性形式也是二聚体，与天然蛋白相同。　　 三、BGalH和rBGalH的酶学性质研究　　 分别以ONPG和乳糖为底物，对天然酶BGalH和重组酶rBGalH进行了最适反应条件的研究和酶学常数的测定。以ONPG为底物，BGalH的最适pH值为8.0,最适温度为40℃，Km值为11.17mM，Kcat值为1097.1s-1；以乳糖为底物，该酶的最适pH为7.5，最适温度为35℃C，Km值为204.6mM，Kcat值为2.3s-1。　　 以ONPG为底物进行了酶稳定影响因素的考察，结果表明，BGalH在pH7.0-9.5可以保持80％以上的活性，在20℃孵育1h后剩余活性有60％以上；多种金属离子不抑制酶活，Fe2+可以显著促进该酶活性(190.1％)，40％(v/v)以下的乙醇能促进酶活性。　　 对重组的rBGalH的酶学性质研究结果表明，以ONPG为底物时，rBGalH的最适pH值为7.0,最适温度为45℃，Km值为2.9mM，Kcat值为390.3s-1；以乳糖为底物时，该酶的最适pH为7.5，最适温度为35℃，Km值为32.06mM，Kcat值为269.5s-1。rBGalH的pH稳定范围变宽，在pH5.5.9.5孵育1h还可保持80％以上的活性；热稳定性提高，在50℃以下孵育1h可保持55％以上的活性。Fe2+可以显著促进该酶活性(218.82％)，Cu2+则显著抑制该酶活性(50.84％)。　　 天然纯牛奶中的乳糖水解实验表明，rBGalH在7℃与牛奶反应12h可检测到乳糖分解产物；在28℃反应24h几乎可以将牛奶中的乳糖分解完全。　　 综上所述，本研究从Halomonassp.S62中获得一个全新的适冷β-半乳糖苷酶基因并获得了纯化的β-半乳糖苷酶蛋白。对其酶学性质的研究表明，该酶pH稳定范围宽、热稳定性好，低温下活性高，耐受的金属离子较多，是一个更适合于在复杂体系中水解乳糖的酶。相信再经过进一步的细致研究后，它将有可能作为一种新的外源性β-半乳糖苷酶，应用于乳制品加工业。