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“第二代燃料乙醇”原料预处理中产生的的盐,如乙酸钠、氯化钠对运动发酵单胞菌(Z.mobilis)的抑制是乙醇发酵中的重要限制因素,是Z.mobilis实现乙醇发酵工业化的瓶颈之一,增强Z.mobilis对盐的耐受性是突破限制因素的有效途径。本课题主要研究NaCl对Z.mobilis生理生化、乙醇合成途径中关键酶的活性影响,及菌体对盐胁迫的应激反应特性,全面分析盐对菌体生理生化及乙醇发酵的影响,初步确定一些相容性物质、抗氧化剂、ATPase以及一些离子在抗盐胁迫中的作用。
分析NaCl胁迫下Z.mobilis232B生理生化特征,揭示Cl-比Na+对细胞的毒害作用大。菌体的比生长速率和最大生物量都显著降低;菌体形态发生变化,呈纤维丝状是正常菌体长度的3-5倍;菌体细胞膜受损,膜通透性显著增大,胞内离子、蛋白质和核酸外泄;菌体胞内离子动态平衡被打破,K+大量外流,Na+大量内流;葡萄糖消耗速度和乙醇合成量均显著降低。
分析NaCl对Z.mobilis232B菌体形态的影响,揭示Cl-干扰菌体的正常分裂,导致菌体分裂受阻,子细胞无法从母细胞上分裂下来,从而导致菌体长度不断增长,最终呈纤维丝状,但这种抑制作用是可逆的;Cl-对菌体的作用靶点,主要是干扰菌体参与细胞分裂的蛋白的合成或抑制其活性,从而影响菌体的正常分裂。
分析NaCl胁迫下Z.mobilis232B乙醇合成途径中关键酶的活性,结果表明,葡萄糖激酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、丙酮酸脱羧酶和乙醇脱氢酶的活性显著降低,而异柠檬酸脱氢酶和苹果酸脱氢酶活性显著增加。这揭示了代谢网络中进入乙醇流向的相关途径中的通量降低而进入TCA途径的碳素流量增加,从而不利于乙醇的合成。
NaCl胁迫下Z.mobilis232B主要积累可溶性糖、游离氨基酸、蛋白质作为渗透保护剂,胞内抗氧化能力显著增强。外源添加渗透压调节物质和抗氧化剂,可有效改善菌体盐耐受性,菌体生长速度和生物量显著增加。
通过比较盐敏感和盐耐受Z.mobilis的ATPase活性和抑制ATPase活性,揭示了Na+-K+-ATPase、Ca2+-ATPase及H+-ATPase在抵抗盐胁迫中发挥的重要作用,Na+-K+-ATPase、Ca2+-ATPase及H+-ATPase活性的增强促进菌体的生长,增强菌体盐耐受性。外源添加K+、Ca2+和Mg2+可有效缓解NaCl对细胞的毒害,促进菌体的生长。