第一部分宫颈癌组织中miR-27a表达状况的研究　　目的：　　研究miR-27a在宫颈癌和正常宫颈组织中的表达差异。　　方法：　　对99例宫颈癌组织和76例正常宫颈组织标本，用原位杂交技术检测 miR-27a在组织中的表达水平。　　结果：　　1、MiR-27a在正常宫颈组织中阳性率较高，在宫颈癌组织中阳性率较低。差异有统计学意义（P<0.01）；　　2、宫颈癌中miR-27a的阳性表达在肿瘤的肿瘤分化程度、浸润深度和组织学类型之间的差异有统计学意义：肿瘤分化程度越低，浸润深度越大，miR-27a表达的阳性率越低；宫颈腺癌组织中，miR-27a的表达明显低于其在宫颈鳞癌中的表达，差异有统计学意义（P<0.001）。　　3、宫颈癌中miR-27a的阳性表达在年龄、脉管癌栓、淋巴结转移和临床分期之间无显著性差异（P>0.05）。　　结论：　　MiR-27a在宫颈癌组织中低表达，尤其在宫颈腺癌组织中特异性低表达。并且肿瘤分化程度越低，浸润深度越大，miR-27a表达的阳性率越低，提示miR-27a与宫颈癌，尤其是宫颈腺癌的发生发展有关。　　第二部分 MiR-27a对宫颈癌细胞恶性生物学行为的影响　　目的：　　研究 miR-27a在宫颈癌细胞中的表达和miR-27a对宫颈癌细胞增殖、凋亡、侵袭和迁移能力的影响。　　方法：　　1、用TagMan探针实时荧光定量法测定 miR-27a在宫颈癌细胞株Hela、Siha和C33A以及正常宫颈脱落上皮中的表达。　　2、通过向细胞中转染 miR-27a模拟物 agomir上调miR-27a的表达。　　3、用EDU检测上调miR-27a表达后宫颈癌细胞的增殖活性。　　4、用CFSE结合流式细胞仪检测上调miR-27a表达后宫颈癌细胞的增殖能力。　　5、用Annexin V-FITC/PI双染法检测上调miR-27a表达后宫颈癌细胞的凋亡。　　6、用Transwell实验检测上调miR-27a表达后宫颈癌细胞的侵袭和迁移能力，　　结果：　　1、MiR-27a在宫颈癌细胞株中的表达较其正常宫颈细胞中明显降低（P<0.001）。　　2、MiR-27a在宫颈腺癌细胞株Hela中的表达低于其在宫颈鳞癌细胞株Siha中的表达（P<0.001）。　　3、向细胞中转染 miR-27a模拟物 agomir后宫颈癌细胞株中miR-27a的表达明显上调（P<0.001）。　　4、上调miR-27a的表达后Hela细胞的增殖活性和增殖能力显著下降（P<0.001），Siha细胞则无此改变。　　5、上调miR-27a的表达后Hela细胞的凋亡明显增加（P<0.001），Siha细胞无明显改变。　　6、上调miR-27a的表达后Hela细胞的侵袭和迁移能力均显著下降（P<0.001），Siha细胞则无明显改变。　　结论：　　MiR-27a在宫颈癌细胞，尤其在宫颈腺癌细胞中低表达；上调miR-27a的表达可以抑制宫颈腺癌细胞的增殖，降低其侵袭和迁移能力，促进其凋亡。　　第三部分 MiR-27a调控宫颈癌恶性生物学行为的机制研究　　目的：　　研究miR-27a在宫颈癌恶性生物学行为的作用机制。　　方法：　　1、生物信息学分析对miR-27a进行靶基因预测。对预测的靶基因集合进行基因本体学（GO）和Pathway分析。　　2、上调miR-27a的表达，用实时荧光定量PCR法检测TGF-βRI和TGF-βRII的mRNA表达水平，Western-Blot免疫印记分析检测TGF-βRI和TGF-βRII的蛋白表达水平。　　3、双荧光素酶报告基因法检测 miR-27a与TGF-βRI mRNA的3’-UTR的结合位点。　　4、向细胞内联合转染miR-27a模拟物 agomir和TGF-βRI过表达质粒后用EDU和CFSE结合流式细胞仪检测细胞增殖能力，Transwell实验检测细胞的侵袭和迁移能力，Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡。　　5、用免疫组化检测99例宫颈癌组织和76例正常宫颈组织中TGF-βRI的表达水平。　　6、进行临床资料分析TGF-βRI和临床病理参数的关系。Spearman’s rank相关分析检测miR-27a和TGF-βRI之间的相关性。　　结果：　　1、生物信息学分析结果显示TGF-βRI是miR-27a重要的潜在作用靶点。　　2、TGF-βRI在宫颈腺癌细胞株Hela中高表达，在宫颈鳞癌细胞株Siha中表达无明显升高。TGF-βR II在Hela和Siha细胞中均呈高表达。　　3、上调miR-27a的表达后Hela细胞的TGF-βRI mRNA水平和蛋白水平均显著降低（P<0.001），而Siha细胞中的TGF-βRI的mRNA水平和蛋白水平在上调miR-27a前后无明显改变。　　4、上调miR-27a的表达后，宫颈癌细胞株Hela和Siha中TGF-βR II的mRNA水平和蛋白水平均无明显改变。　　5、双荧光素酶报告实验证实 miR-27a可特异性的与TGF-βRI mRNA的3’-UTR结合，抑制TGF-βRI的表达。　　6、同时上调miR-27a和TGF-βRI的表达后，Hela细胞中TGF-βRI的表达和单独上调miR-27a相比，增加至接近未处理组水平。抵消了单独上调miR-27a对TGF-βRI的作用。Siha细胞中TGF-βRI的表达水平无明显改变。　　7、同时上调miR-27a和TGF-βRI的表达后，Hela细胞的增殖、侵袭和转移能力和单独上调miR-27a相比，增加至接近未处理组水平。Hela细胞的凋亡减少至未处理组水平。抵消了单独上调miR-27a对Hela的恶性生物学行为的影响。Siha细胞的增殖、侵袭和迁移能力及凋亡在调控前后无明显改变。　　8、免疫组化染色发现TGF-βRI在宫颈癌组织，尤其在宫颈腺癌中高表达（P<0.001）。正常宫颈组织中TGF-βRI全部为低表达。　　9、宫颈癌组织中TGF-βRI的高表达与肿瘤的分化程度、淋巴结转移、浸润深度和组织学类型密切相关。宫颈癌的肿瘤分化程度越差、浸润深度越大，TGF-βRI的表达越高。有淋巴转移组TGF-βRI的表达也明显高于无淋巴转移组。　　10、宫颈癌组织和正常宫颈组织中TGF-βRI的表达和miR-27a的表达呈负相关，差异有统计学意义（P<0.001）。　　结论：　　在宫颈腺癌中miR-27a通过靶向调控TGF-βRI抑制宫颈癌细胞的增殖，降低其侵袭和迁移能力，促进其凋亡。　　第四部分 MiR-27a抑制宫颈癌生长的体内研究　　目的：　　探讨miR-27a抑制裸鼠宫颈腺癌皮下移植瘤生长的作用，并在体内水平验证其对TGF-βRI的调控。　　方法：　　1、建模：将宫颈腺癌细胞Hela注射入裸鼠皮下建立裸鼠皮下移植瘤模型。　　2、分组：成瘤后且最大瘤体积达到100mm3时，将21只裸鼠随机分为3组：miR-27a agomir处理组、miR-27a agomir NC处理组和PBS处理组。分别瘤内注射miR-27a agomir、miR-27a agomir NC或PBS100uL/3天，共两周。　　3、观察指标：　　（1）观察裸鼠的饮食、体重、精神状态/天。　　（2）观察裸鼠皮下瘤的生长情况，游标卡尺测量皮下瘤体积/2天。　　（3）全部处理结束5天后，处死裸鼠，取肿瘤组织作HE染色。　　（4）免疫组化检测皮下瘤组织中TGF-βRI的表达，并用免疫组化评分系统评价各组TGF-βRI的表达情况。　　（5）免疫组化检测皮下瘤组织中增殖指标Ki-67的表达，用Image Proplus5.1软件分析各组Ki-67阳性细胞百分比。　　结果：　　1、MiR-27a agomir处理组的相对瘤体积由1.26增加至1.55；miR-27a agomir NC处理组的相对瘤体积由1.66增加至2.85；PBS处理组的相对瘤体积由1.34增加至3.25。miR-27a agomir处理组的相对瘤体积明显小于其余两组。差异有统计学意义（P<0.01）。　　2、MiR-27a agomir处理组肿瘤组织中TGF-βRI的表达明显低于miR-27a agomir NC处理组和PBS处理组，差异有统计学意义（P=0.002）。　　3、MiR-27a agomir处理组中Ki-67阳性细胞百分比明显低于MiR-27a agomir NC处理组和PBS处理组，差异有统计学意义（P<0.001）。　　结论：　　MiR-27a通过靶向作用于TGF-βRI抑制裸鼠体内宫颈腺癌移植瘤的生长。