研究背景和目的：肿瘤的发生是一个渐进过程,涉及多级反应和突变的累积。转移是恶性肿瘤区别于良性肿瘤的重要特性,肿瘤的转移与肿瘤微环境是密切相关的。肿瘤微环境是由肿瘤细胞和多种基质细胞、肿瘤相关免疫细胞、细胞因子、趋化因子等组成,在发展过程中肿瘤细胞会对周围微环境进行修饰使其更适应失控的自我更新和分化模式。肿瘤细胞可以通过自分泌和旁分泌,维持和改变自身生存和发展的条件,促进肿瘤的生长和发展。肿瘤微环境中细胞间主要通讯分子之一是存在于细胞间质的分泌蛋白质,它是微环境中各种细胞所分泌蛋白质的综合产物。细胞间的通讯都是这些释放的蛋白去结合到其他细胞表面的受体上来完成的,但是细胞也分泌更复杂的结构,称之为膜囊泡,这类分泌囊泡的一种类型是外泌体,由嵌入跨膜蛋白的脂质双层组成,包裹着亲水成分。外泌体是细胞内多泡体与细胞膜融后释放到细胞外的纳米级膜性囊泡,直径在30-100m之间,内部包含有miRNA、mRNA和胞质蛋白,由多种细胞分泌,介导细胞间物质与信息传递。肿瘤来源的外泌体存在于肿瘤细胞培养上清液、肿瘤患者血浆或者恶性渗出液中,通过改变肿瘤微环境,促进肿瘤血管新生和肿瘤转移,以及直接作用于肿瘤细胞等途径,影响肿瘤的进展。确定肿瘤相关的外泌体蛋白和RNA,能使这些囊泡成为新的生物标记来源并用来监测健康状态。外泌体的传统提取过程较繁琐低效,不利于外泌体的研究。因此我们先要建立并验证一个简便高效地提取肿瘤来源外泌体的新方法。TP53是迄今发现与人类肿瘤相关性最高、研究最多的基因之一。起初TP53被认为是一个原癌基因,随着对TP53研究的深入,现在公认TP53是一个肿瘤抑制基因。p53蛋白有很广泛的功能,包括细胞周期停滞、诱导凋亡发生、介导细胞衰老、维持基因稳定、调节血管生成、细胞分化和免疫反应。TP53约在50%的肿瘤中发生突变,TP53发生突变,就会丧失野生型TP53所具有抑癌功能,同时获得许多癌基因的特殊功能。大量临床研究证实273位点是结肠癌TP53基因突变热点,与肿瘤的发生密切相关,因此TP53基因的273位点成为目前研究肿瘤发生发展的热点。肿瘤的发展离不开肿瘤微环境,所以确定突变的TP53对肿瘤微环境的影响是十分必要的。虽然目前已知突变的TP53是如何影响肿瘤细胞生物学行为,但突变的TP53对肿瘤细胞分泌到肿瘤微环境中的分泌蛋白质的影响却知之甚少。除了经典的分泌蛋白以外,外泌体是非经典分泌蛋白释放的主要途径之一。因此另一个目的是比较分析TP53突变、敲除及野生的肿瘤细胞分泌外泌体的蛋白质组差异,探讨突变的TP53对肿瘤微环境中的分泌蛋白质的影响。方法：采用一种新型纳米材料分离出Huh7肝癌细胞培养上清中的外泌体,利用透射电镜观察其形态和免疫印迹检测其生物标记蛋白,并比较了传统超速离心和纳米材料提取肝癌细胞培养上清中的外泌体的蛋白量和形态。此外,我们从肝癌细胞培养上清分离纯化的外泌体中,对肝癌相关蛋白组织转谷氨酰胺酶(tissue transglutaminase 2, TGM2)和膜联蛋白A2 (annexing A2)进行了免疫印迹检测。从TP53野生型、敲除型和构建的273位点突变型的结肠癌HCT116细胞培养上清中分别提取外泌体,通过透射电镜观察其形态和免疫印迹法检测外泌体标志性蛋白,以确定该纳米材料能够快速高效的分离纯化外泌体,用标尺测量电镜下随机选取的若干个视野的200个外泌体直径,比较三种细胞系分泌的外泌体大小。最后,经iTRAQ-LC-MS/MS策略分析三种细胞外泌体蛋白组成的差异并通过酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)进行差异蛋白验证。结果：第一部分：透射电镜下观察外泌体为直径在30-100nm的圆盘状完整囊泡并且免疫印迹结果显示膜表面的标志性跨膜蛋白CD63、热休克蛋白HSP70阳性,新型纳米材料提取的外泌体蛋白量(780μg/108个细胞)比传统方法提取外泌体的蛋白量高出约19倍。通过在外泌体中检测肝癌相关蛋白膜联蛋白(annexin A2)和组织转谷氨酰胺酶(tissue transglutaminase 2, TGM2)发现,TGM2存在于肝癌细胞分泌的外泌体中,而annexin A2阴性。第二部分：透射电镜显示TP53野生型HCT116细胞分泌的外泌体相比于TP53敲除型和273位点突变型HCT116细胞分泌的外泌体较大。TP53野生型HCT116细胞分泌的外泌体和TP53突变型HCT116细胞分泌的外泌体相比有144个差异蛋白,TP53野生型HCT116细胞分泌的外泌体和TP53敲除型HCT116细胞分泌的外泌体相比有480个差异蛋白,大部分差异蛋白主要参与代谢和细胞的生物学过程以及凋亡、应激、增殖、细胞粘附等功能。通路分析(Ingenuity Pathway Anaylsis, IPA)软件上显示TP53野生型HCT116细胞分泌的外泌体相比于273位点突变型HCT116细胞分泌的外泌体的差异蛋白主要富集在泛素化、mTOR、DNA损伤修复通路中；TP53野生型HCT116细胞分泌的外泌体相比于TP53敲除型HCT116细胞分泌的外泌体的差异蛋白主要集中在泛素化、EIF2、糖酵解通路中。而且,结肠癌患者的血清视网膜母细胞瘤蛋白(Retinoblastoma protein, RB1)水平明显高于健康对照(P=0.0012)。结论：第一部分：该纳米材料能够快速高效地分离提取肝癌细胞分泌的外泌体,并且证实TGM2是通过外泌体这种非经典途径分泌到细胞外。第二部分：TP53突变和缺失会改变外泌体的蛋白组成,富集许多泛素化蛋白。推测突变的TP53通过影响外泌体中的泛素化蛋白来进一步调节分选其他内容物进入外泌体,突变的TP53可以通过外泌体这一非经典分泌途径改变细胞的信号释放,为周围的肿瘤细胞提供生长条件。研究结果将为深入探讨TP53状态对外泌体蛋白组成和肿瘤微环境的影响奠定基础。此外,结肠癌患者的血清RB1水平明显高于健康对照,这和前期文献报道一致,也和我们的质谱定量结果相吻合,推测表达高水平RB1的外泌体作为肿瘤细胞间信号交流的介质,可以抑制肿瘤细胞的凋亡,从而促进肿瘤的进展。主要创新点：1、传统外泌体提取方法主要基于超速离心、蔗糖密度梯度离心等技术,较费时费力。相比之下,本文采用新型纳米材料分离提取外泌体,步骤简便高效,外泌体在开放系统中暴露的时间短,不易被环境和细胞碎片污染。2、同时提取TP53基因突变、敲除和野生型的肿瘤细胞外泌体,分离、鉴定和验证了差异蛋白,初步探讨了TP53对肿瘤微环境的影响。