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囊型包虫病是由细粒棘球绦虫的中绦期幼虫引起的一种人兽共患寄生虫病,是严重威胁全球公共卫生的疾病之一,仅在中国每年就造成大约30亿元的经济损失。细粒棘球绦虫呈全球性分布,我国主要分布在青海、甘肃、西藏、新疆、内蒙古等农牧和半农半牧地区。近年来的诸多研究表明,寄生虫编码的microRNAs(miRNAs)分子能够通过调节宿主的免疫功能促进其在宿主体内的寄生。因此,开展细粒棘球蚴miRNA分子的分泌表达特征及生物功能研究,对寻找新型的抗寄生虫药物和诊断试剂靶标具有重要意义。鉴于此,本研究主要开展了以下几个方面的研究:1.为了分析miR-71在细粒棘球蚴中的组织分布及分泌表达情况,合成miR-71核酸探针,利用原位杂交技术分析miR-71在细粒棘球蚴中的组织分布;在人工胃液(人工胃液组)、胰岛素(胰岛素组)或阿苯达唑(阿苯达唑组)等不同条件下培养细粒棘球蚴,收集上清并用差速离心法分离外泌体,采用透射电镜观察外泌体形态结构,利用纳米粒径分析仪测定外泌体的粒径分布;利用外泌体生物标志分子烯醇化酶和14-3-3蛋白的抗体蛋白质免疫印迹(Western blotting)鉴定外泌体;采用实时荧光定量PCR检测外泌体中miR-71的丰度。原位杂交结果显示,miR-71在发育中期和晚期的原头节以及囊壁生发层中均有表达。人工胃液组、胰岛素组和阿苯达唑组细粒棘球蚴分泌的外泌体粒径分别为48.9、49.7和65.4 nm,均在40~120 nm内;外泌体形态呈由膜包裹的球形。Western blotting从外泌体检出烯醇化酶和14-3-3蛋白,表明外泌体提取成功。qPCR结果显示,人工胃液组、胰岛素组和阿苯达唑组细粒棘球蚴分泌的外泌体中,miR-71的表达量分别是其对照组的1.84、1.87和2.38倍(P<0.01)。2.为了探究细粒棘球蚴外泌体是否能够进入宿主细胞,用PKH-26细胞膜染料对外泌体进行染色,与小鼠巨噬细胞RAW264.7、小鼠肝细胞NCTC1469和人肾上皮细胞HEK-293t进行共孵育。通过激光共聚焦显微镜观察外泌体定位情况,利用流式细胞仪检测外泌体的内化效率。结果显示,各组外泌体均被RAW264.7、NCTC1469和HEK-293t细胞内化至细胞质内,内化率分别为72.1%、18.2%和18.5%。其中RAW264.7细胞中外泌体的内化率明显高于NCTC1469和HEK-293t细胞组,差异极显著(P<0.01)。3.为了初步分析外泌体中miR-71的生物活性,采用miR-71的已知靶基因NLK的3’UTR,构建野生型和突变型荧光报告质粒,分别与miRNA阴性对照、miR-71模拟物和外泌体共转染HEK-293t细胞,采用流式细胞仪检测HEK-293t细胞的平均荧光强度。结果显示,与对照组相比,野生型pCMV-eGFP-NLK-WT与miR-71模拟物和外泌体共转染组的MFI值明显降低,差异极显著(P<0.01)。突变型pCMV-eGFP-NLK-Mut与miR-71模拟物、外泌体共转染组的MFI值无明显变化,差异不显著(P>0.1)。结论:miR-71在细粒棘球蚴原头节及囊壁中广泛表达。宿主体内的不同环境能够刺细粒棘球蚴大量表达miR-71,并通过外泌体进入宿主细胞质内,特别是免疫细胞中。外泌体中的miR-71能够与已知的靶基因相互结合,初步表明其具有生物活性。