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杂交和多倍化是植物物种形成和进化的重要力量,是植物多样性产生和发展的一个重要源泉,绝大多数(如果不是全部)植物在其进化历史中至少经历了一次多倍化事件(Blanc&Wolfe,2004)。许多以前认为是二倍体的植物,如玉米(Gaut&Doebley,1997)、拟南芥(Kuetal.,2000;Patersonetal.,2000)等,目前在分子水平上被证明是古多倍体。有证据表明绝大部分多倍体植物是多元起源的(recurrentformation),并包含多个源于独立起源而形成的不同谱系,基于不同居群独立发生的多倍化过程可能涉及同一种内形态或遗传特性不同的居群,因而会导致产生一系列在遗传结构上存在差异的多倍体居群,这是多倍体种遗传多样性的一个重要来源。此外,独立起源的不同多倍体谱系之间的基因流则导致在多倍体水平上表现出更加复杂的遗传变异式样,从而对多倍体植物的适应性产生影响。
野菊(ChrysanthemumindicumL.)主要分布在我国长江流域及长江以南各省区,包含二倍体(2n=2x=18)和四倍体(2n=4x=36)两种细胞型。但不同地区分布的二倍体和四倍体在外部形态和核型特征上都表现一定程度的差异,并有相当一部分个体的形态特征介于野菊和另一个二倍体近缘种甘菊(C.lavandulifolium)之间,表明在两者之间发生了种质渗入(intrograssivehybridization)的过程。因此,野菊的不同细胞型以及甘菊共同组成了一个在形态上连续过渡、种间界限模糊不清的多倍体复合体。对该复合体内不同类群的变异式样、变异规律、多倍体基因组产生的途径以及多倍化后多倍体基因组的进化动态目前还缺乏深入的研究。
在本项研究中,我们综合运用形态地理、细胞学和分子系统学的研究方法,从居群的角度对野菊及其相关类群的变异式样、变异规律、以及变异的遗传基础进行了较为全面的分析和比较:运用分子标记技术(RAPD、ISSR)、DNA序列分析技术(双亲遗传的rDNAITS、母系遗传的cpDNA的trnT-trnF、trnLintron、trnL-trnF和cpSSR)、核型分析(karyotypeanalysis)以及染色体原位杂交技术(FISH和GISH)比较不同倍性基因组的相互关系,判断并确定多倍体的性质、起源方式、途径及其与物种形成和分化的关系,分析不同起源方式(单元起源或多元起源)对野菊多倍体遗传结构及其适应性发展的影响,进而深入探讨多倍化在菊属植物物种形成和分化过程中的作用和意义,同时为阐明野菊复合体中不同类群(包括:野菊C.indicum、神农香菊C.indicumvar.aromaticum、菊花脑C.nankingense、和甘菊C.lavandulifolium)的系统发育关系、进行科学的分类处理提供依据。主要研究结果如下:
1、尽管野菊多倍体复合体中包含一系列不同的细胞型,并在形态特征及地理分布式样上表现一定程度的差异,但从总体上来看,野菊多倍体复合体中不同类群遗传分化的程度较低,ITS和叶绿体非编码序列都不能提供足够的信息用以阐明不同类群间的系统发育关系。此外,该复合体中不同类群的染色体形态极为相似,多为中部或亚中部着丝点染色体,以三个二倍体类群的基因组DNA为探针分别与四倍体野菊的染色体进行杂交,发现几乎所有染色体都显示很强的杂交信号,没有发现特异片段或条带,说明这些类群染色体组之间具有高度的同源性。
2、综合RAPD、ISSR和cpSSR的研究结果可以看出,神农架地区分布的四倍体野菊与神农香菊在遗传组成上表现出很高的相似性,在神农香菊基因组内扩增出的所有RAPD和ISSR条带中,高达69.5﹪的条带也出现在神农野菊四倍体基因组中;神农架野菊四倍体基因组中只包含神农香菊的特异性条带,没有另外两个二倍体,即菊花脑和甘菊的特异性条带。此外,cpSSR的分析结果显示神农香菊(3D,1A,1E)包含了所有出现在神农架野菊叶绿体基因组中的单元型种类(4D,1A),神农架野菊和神农香菊叶绿体单元型之间的这种隶属关系以及两者在核基因组组成上显示出的高度相似性表明神农架四倍体野菊有可能是由神农香菊通过同源多倍化的途径而产生。
3、甘菊是四倍体野菊基因组的二倍体亲本之一,甘菊特异的RAPD和ISSR条带几乎遍及野菊的所有居群(除神农架野菊外),而且出现的频率相对较高;菊花脑也参与了部分四倍体野菊类群的形成,如:武汉野菊,但其作用远不及甘菊,因为从二倍体特有的RAPD和ISSR条带的分布式样看,多数四倍体野菊居群中不包含菊花脑特有的DNA扩增条带。根据cpSSR分析的结果推测,四倍体野菊可能具有除神农香菊、菊花脑和甘菊以外的二倍体祖先,如:具有G型叶绿体单元型的二倍体祖先,该单元型以较高的频率出现在不同四倍体野菊居群中。
4、综合分析染色体组、核基因组和叶绿体基因组的证据,可以推测四倍体野菊至少通过三次独立的多倍化事件产生,其中:神农架野菊起源于神农香菊的同源多倍化过程;南京野菊由于在RAPD和ISSRPCA图上始终与其它类群保持明显的分离状态,且具有独特的叶绿体单元型类型B,显示了其起源的独特性;其余7个四倍体居群关系较近,尽管不同分子标记显示的结果不完全相同。这些起源于不同二倍体亲本的四倍体野菊代表了不同的遗传谱系,但由于在不同谱系之间存在广泛的杂交和重组,导致不同谱系在核基因组以及叶绿体基因组特征上表现相当程度的重叠现象。
5、野菊的不同地方居群是通过多次独立的多倍化过程而产生的,并涉及不同的祖先。因此,严格地讲四倍体野菊不是单系发生的(monophyletic),而是一个隐形的种系发生种(crypticphylogeneticspecies)。本文的研究结果支持将菊花脑作为独立的种从野菊中分离出来,不支持将神农香菊作为独立的种处理。甘菊与野菊之间显然存在渐渗杂交的过程,结果不仅导致在野菊基因组中出现许多甘菊的组份,而且导致产生许多在形态上处于中间状态的个体,给分类带来困难。