乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus, HBV)简称乙肝病毒,属于嗜肝DNA病毒科(Hepadnavividae),是一种逆转录DNA病毒。HBV不仅引起急性肝炎(Acute hepatitis B, AHB)和慢性肝炎(Chronic hepatitis B, CHB),还可导致肝硬化,并与肝癌的发生密切相关,严重危害人类健康。约有5%的HBV急性感染者不能有效清除HBV,导致病毒的持续感染,甚至最终发展为肝硬化或肝癌。HBV感染的致病机制涉及病毒和机体两方面——乙型肝炎病毒在感染肝细胞内的复制增殖所致细胞损伤有限,而宿主的细胞免疫应答引起的免疫病理变化是导致肝细胞损伤的主要因素。在乙肝病毒所致的急性和慢性感染时,机体免疫状态不同。急性乙肝患者体内辅助性T细胞1类细胞(Helper T cell 1, Thl)应答模式占优势,上升的Thl类细胞因子促进细胞毒性T淋巴细胞(Cytotoxic T cell, CTL)参与乙肝病毒的清除；而慢性乙肝患者体内存在明显的Thl/辅助性T细胞2 (Helper T cell 2, Th2)平衡漂移,表现为Thl类细胞因子减少,Th2类细胞因子增加。组蛋白赖氨酸去甲基化酶1 (Lysine specific demethylase 1, LSD1)是一种黄素腺嘌呤二核苷酸(Flavin adenine dinμlcleotide, FAD)依赖性单胺氧化酶,LSD1定位于细胞核内,可特异性脱去单甲基化和二甲基化组蛋白H3第4位赖氨酸(Histone 3 lysine 4, H3K4)和H3第9位赖氨酸(Histone 3 lysine 9, H3K9)位点上的甲基基团,动态调节组蛋白的甲基化状态,影响组蛋白和其他功能蛋白的相互作用,进而调控基因转录的激活和抑制。本课题从CHB患者和动物模型两方面探讨LSD1与Th1/Th2平衡漂移,进而影响HBV清除的关系,研究LSD1在乙肝病毒感染中的作用及机制。为进一步阐明CHB发病机制及免疫治疗靶点提供理论和实验依据。第一部分LSD1在HBV感染中的作用及机制研究目的：本部分实验旨在了解CHB患者外周血CD4+Th细胞LSD1表达水平与Th1/Th2平衡漂移的关系,探讨LSD1介导的组蛋白修饰对CHB患者CD4+Th细胞分化的作用,观察LSD1抑制剂反苯环丙胺(Tranylcypromine, TCP)对CD4+Th细胞Th1/Th2分化的影响,探讨TCP在调控Thl/Th2分化平衡中的作用及机制。方法：248名2011年1月至2014年6月在南通大学附属医院住院CHB患者和206名健康体检者作为对照进行实验。观察CHB患者的外周血CD4+Th细胞中LSD1表达水平、血清中IFN-γ和IL-4水平；TCP干预后Th1、Th2细胞频率和Thl型转录调控因子T-bet、调控因子磷酸化信号转导和转录活化因子1 (Phosphorylated signal transducers and activators of transcription, pSTATl)以及二甲基组蛋白H3赖氨酸4 (Dimethylation of histone 3 lysine 4, H3K4me2)表达状况。1.根据入院时的肝功能、HBV两对半及HBV-DNA定量的检验结果,将248例CHB患者分为四组：(1)乙型肝炎表面抗原(Hepatitis B surface antigen, HBsAg)高水平组(HBsAg>250 IU/ml)与低水平组(HBsAg≤,250 IU/ml); (2)乙型肝炎e抗原(Hepatitis B e antigen, HBeAg)阳性组与阴性组；(3)丙氨酸氨基转移酶(Alanine aminotransferase, ALT)高水平组(ALT>3*检测上限)与低水平组(ALT<3*检测上限)；(4) HBV-DNA高载量组(HBV-DNA>105 copy/ml)与低载量组(HBV-DNA<105 copy/ml)。采用微粒子化学发光法检测血清HBsAg和HBeAg含量；全自动生化仪检测ALT；实时定量PCR (RT-PCR)法检测血清HBV-DNA载量。2.采用密度梯度离心法分离CHB患者和对照组外周血淋巴细胞,免疫磁珠法分选CD4+Th细胞和流式细胞仪检测CD4+Th细胞的纯度。提取CHB患者和对照组CD4+Th细胞总蛋白,蛋白质免疫印迹法(Western blot, WB)检测LSD1表达。采用ELISA法检测CHB患者和对照组血清中IFN-γ和IL-4含量。3.采用密度梯度离心法分离正常人外周血淋巴细胞,免疫磁珠抗CD3单抗和抗CD28单抗刺激分选的CD4+Th细胞,活化后加入不同浓度的LSD1抑制剂TCP (10,30,50,80,100 μM)作用24h, CD4-PerCP-Cy5.5/IFN-γ-FITC/IL-4-PE三色流式细胞术检测Th1、Th2细胞频率；(3)WB检测Thl型调控因子T-bet、STAT1和pSTAT1蛋白表达。(4)WB检测H3K4me2和LSD1的表达。结果：1.对照组CD4+Th细胞纯度为(96.9±2.3)%,CHB患者组CD4+Th细胞纯度为(96.5±2.5)%,两组差异无统计学意义(P>0.05)。(1) CHB组外周血CD4+Th细胞LSD1表达水平高于对照组,差异有统计学意义(P<0.01)。CHB患者各组外周血CD4+Th细胞LSD1表达：HBsAg高水平组>低水平组(P<0.05); HBeAg阳性组>阴性组(P<0.01); ALT高水平组<低水平组(P<0.05); HBV-DNA高载量组>HBV-DNA低载量组(P<0.05),差异均有统计学意义。(2)与对照组相比,CHB患者血清IFN-γ显著降低(P<0.01)；IL-4水平无明显变化,差异无统计学意义(P>0.05); IFN-γ/IL-4比值明显降低(P<0.01)。CHB患者各组血清IFN-γ及IFN-y/IL-4:HBsAg高水平组<低水平组(P<0.01);HBeAg阳性组<阴性组(P<0.01)；ALT高水平组>低水平组(P<0.01); HBV-DNA高载量组<低载量组(P<0.01),差异均有统计学意义。血清IL-4水平在HBsAg高水平组与低水平组,HBeAg阳性组与阴性组,ALT高水平组与低水平组和HBV-DNA高载量组与低载量组间比较均无统计学差异(P>0.05)。(3) CHB患者外周血CD4+Th细胞LSD1表达量与血清IFN-γ水平呈负相关(P<0.01)；与血清IL-4水平无相关(P>0.05)；与IFN-γ/IL-4呈负相关(P<0.01)。2.在不同浓度TCP干预下：(1)随着TCP浓度增加,不同实验组IFN-γ阳性细胞频率均明显高于对照组；IL-4阳性细胞频率无显著差异(P>0.05)。(2)与对照组相比,TCP干预组CD4+Th细胞Thl型特异转录因子T-bet表达明显增加(P<0.01),上游调控因子STAT1磷酸化(Phosphorylated STAT1, pSTAT1)程度显著增加(P<0.01),STAT1总蛋白的表达无明显变化(P>0.05) (3) H3K4me2表达增加(P<0.01)。结论：1.CHB患者外周血CD4+Th细胞LSD1表达水平高于对照组,且实验组中代表HBV感染程度的HBsAg, HBeAg、HBV-DNA载量高水平组,其LSD1表达水平高于各指标的低水平组。在显示肝组织损伤程度的ALT低水平组,LSD1表达量高于ALT高水平组,提示LSD1的低表达有利于Thl细胞分化并能上调细胞免疫应答,产生效应性细胞毒性T淋巴细胞(Cytotoxic T lymphocyte, CTL),导致大量被HBV感染的肝细胞损伤,释放过量ALT至外周血。2.CHB患者外周血中Thl型细胞因子IFN-γ表达水平低于对照组,与外周血CD4+Th细胞LSD1表达水平呈负相关,实验组中HBsAg、HBeAg、HBV-DNA载量高水平组,IFN-γ均低于各指标低水平组；Th2型细胞因子IL-4则均无明显变化。以上结果提示LSD1可通过影响Thl分化,导致CHB患者Th1/Th2平衡漂移。3.TCP干预后,IFN-γ阳性细胞频率明显高于对照组,Thl型特异转录因子T-bet表达明显增加,上游调控因子STAT1磷酸化(pSTAT1)水平显著增加,提示其通过T-bet/STAT1信号转导通路抑制LSD1的活性；LSD1的底物H3K4me2表达水平上升,进一步证实TCP是良好的LSD1活性抑制剂。综上所述,本研究结果表明LSD1高表达是CHB患者体内Thl分化水平下降、Th1/Th2分化失衡并导致对HBV清除或抑制HBV复制能力减弱的原因之一。提示LSD1高表达参与了慢性HBV感染的致病过程,调节LSD1表达可成为针对HBV感染的潜在治疗靶点。第二部分下调LSD1对HBV感染小鼠模型的作用及机制研究目的：通过小鼠尾静脉高压注射HBV1.3倍长重组质粒建立HBV小鼠模型。使用TCP和LSD1siRNA下调HBV小鼠模型体内LSD1的表达,通过观察HBV小鼠模型体内HBV抗原和DNA的变化及组织病理学检测的改变,判断下调LSD1对HBV模型小鼠清除HBV的影响。通过观察HBV模型小鼠与TCP和LSD1 siRNA处理小鼠脾脏来源的淋巴细胞中LSD1的表达变化,及体外转染骨髓来源的树突状细胞(Dendritic cells, DC)细胞中LSD1的表达情况和表型的改变,探讨其作用机制。检测外周血和脾脏CD4+Th细胞IFN-γ和IL-4的表达,观察小鼠脾细胞Thl相关的转录调控因子T-bet和pSTAT1以及LSD1、H3K4me2的表达水平的变化；探讨LSD1酶活性改变与HBV感染小鼠免疫细胞Th1/Th2平衡漂移的关系以及抑制LSD1酶活性对HBV感染病毒清除的影响及机制。方法：1.将100μg重组的HBV1.3倍长重组质粒经尾静脉高压注射BALB/C小鼠,建立HBV小鼠感染模型。(1)4d后ELISA法检测小鼠血清HBsAg;(2)实时定量PCR检测HBV-DNA载量；(3)HE染色观察肝细胞变化；(4)免疫组化检测肝组织HBsAg、HBcAg和HBeAg分布,确定HBV感染小鼠模型的建立。2.将BALB/C小鼠随机分成4组,每组20只：对照组(仅尾静脉注射1 ml生理盐水)；模型组(尾静脉注射HBV1.3倍长重组质粒与等体积生理盐水)；LSD1siRNA组(尾静脉注射HBV1.3倍长重组质粒与等体积溶解50 μg LSD1 siRNA的生理盐水)；TCP组(尾静脉注射HBV1.3倍长重组质粒与等体积溶解TCP终浓度为60μM的生理盐水)。对各组小鼠(1)采用全自动微粒子化学发光法检测外周血第0d、4 d、8 d和12 d HBsAg的表达情况；(2)实时定量PCR检测HBV-DNA载量；(3)免疫组化检测肝组织HBsAg表达水平；(4)分离各组小鼠的脾淋巴细胞,提取全细胞蛋白,WB检测脾脏来源的淋巴细胞LSD1的表达情况；(5)将体外诱导各组小鼠骨髓来源的DC,提取细胞总蛋白,WB检测LSD1的表达水平；采用流式细胞术检测各组小鼠骨髓来源的DC表面MHC-Ⅱ、D11c、CD80和CD86分子的表达变化；(6)用ELISA检测小鼠外周血中细胞因子IFN-γ和IL-4的表达；通过免疫磁珠分选试剂盒获取小鼠脾脏中CD4+Th细胞,部分通过胞内细胞因子染色,经流式细胞术分别检测Thl和Th2细胞特异性细胞因子IFN-γ和IL-4的表达,部分用于提取细胞蛋白,WB检测CD4+Th细胞中LSD1、H3K4me2、STAT1和T-bet的表达。结果：1.尾静脉高压注射HBV1.3倍长重组质粒小鼠4天后,检测发现(1)外周血HBsAg阳性；(2) HBV-DNA载量达到最高峰；(3)肝细胞无明显病理改变；(4)肝组织中HBsAg广泛存在,HBcAg和HBeAg未见分布,说明HBV感染模型构建成功。2.LSD1 siRNA和TCP组小鼠与模型组小鼠相比(1)各时间点血清HBsAg表达较后者显著降低(P<0.01)；(2)血清HBV-DNA载量明显低于后者组(P<0.01)；(3)肝脏HBsAg显著减少(P<0.01)；(4)脾脏来源的淋巴细胞中LSD1的表达较后者显著降低(P<0.05)；(5)骨髓来源的DC LSD1表达水平较后者明显下降(P<0.01),表型分析结果显示,LSD1 siRNA组较后者DC表面分子MHC-Ⅱ、 CD11c、CD80和CD86分子表达上调(P<0.01)；(6)外周血中IFN-γ的表达高于模型对照组,差异有统计学意义(P<0.05),而各处理组IL-4的表达无统计学差异(P>0.05); IFN-γ阳性细胞频率高于模型对照组(P<0.05),而各组IL-4阳性细胞频率无明显差异(P>0.05); TCP组和LSD1 siRNA组Thl相关的转录调控因子pSTAT1和T-bet的表达均高于对照组(P<0.05)；模型对照组和TCP组LSD1的表达高于LSD1 siRNA组(P<0.05),而模型对照组H3K4me2的表达低于TCP组和LSD1siRNA组(P<0.05)。结论：1.用尾静脉高压注射HBV1.3倍长重组质粒可简便有效的构建HBV感染的小鼠模型,为研究HBV感染创造条件。2.通过TCP或LSD1siRNA干预,感染小鼠DC表面与抗原提呈相关分子MHC-Ⅱ、CD80和CD86表达水平增高,表明两种干预方法均可增强小鼠DC的抗原提呈功能,进而促进HBV清除。3.通过TCP或LSD1siRNA干预：感染小鼠外周血IFN-γ和IFN-γ阳性细胞频率均出现明显增高,提示促进小鼠脾脏Thl/Th2分化平衡向Th1细胞偏移；Th1型特异转录因子T-bet表达明显增加,上游调控因子STAT1磷酸化(pSTAT1)程度显著增加,亦显示其可调控CD4+Th细胞分化向Th1型漂移,机制是通过对T-bet/STAT1信号转导通路产生影响进而抑制了LSD1的活性。4.结果显示模型对照组和TCP组LSD1的表达高于LSD1siRNA组,而模型对照组H3K4me2的表达低于TCP组和LSD1siRNA组。表明TCP干预降低了LSD1的酶活性,使得H3K4me2蛋白的表达增加,但并未抑制LSD1的表达。综上所述,本研究应用尾静脉高压注射HBV1.3倍长重组质粒构建HBV感染的小鼠模型,用TCP或LSD1 siRNA干预后,小鼠DC表面与抗原提呈相关分子MHC-Ⅱ、CD80和CD86表达水平增高,表明两种干预方法均可增强DC的抗原提呈功能,进而促进HBV清除。在感染小鼠体内应用TCP或LSD1 siRNA干预后,促进了脾脏Th1/Th2分化平衡向Th1细胞偏移,能加快体内HBV的清除。上述结果为表观遗传学调控参与HBV感染的发生和发展提供了理论和实验依据。