【摘 要】
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中国对虾（Penaeus chinensis）因其营养丰富广受消费者青睐。原肌球蛋白（TM）是引起虾类过敏反应最主要的蛋白质,引起过敏反应的并不是整个TM蛋白,而是TM蛋白上的一些片段即抗原表位,通过对抗原表位的加工可以改变其构象并影响致敏性。低温等离子体（CP）作为一种新型非热加工技术和高级氧化手段,可以有效改变蛋白质的构象,进而影响蛋白质的功能特性。目前关于CP介导的氧化处理对抗原表位及关键氨
【基金项目】
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国家自然科学基金面上项目（等离子体氧化微环境对虾类TM结构及致敏性的影响机制,31972205）；
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中国对虾（Penaeus chinensis）因其营养丰富广受消费者青睐。原肌球蛋白（TM）是引起虾类过敏反应最主要的蛋白质,引起过敏反应的并不是整个TM蛋白,而是TM蛋白上的一些片段即抗原表位,通过对抗原表位的加工可以改变其构象并影响致敏性。低温等离子体（CP）作为一种新型非热加工技术和高级氧化手段,可以有效改变蛋白质的构象,进而影响蛋白质的功能特性。目前关于CP介导的氧化处理对抗原表位及关键氨基酸的影响研究鲜有报道。因此,本课题以中国对虾中TM的抗原表位为研究对象,以CP介导的氧化微环境为切入点,结合等离子体物理学、分子生物学、生物信息学及免疫学等技术,从抗原表位预测、三维空间结构模拟、关键氨基酸分析、表位免疫学和结构变化、活性粒子屏蔽等几个方面,探究了CP氧化微环境对TM抗原表位结构的破坏及关键氨基酸的变化及过敏原性的影响,阐明了抗原表位结构（关键氨基酸）变化与致敏性之间的相互关系,为CP新型物理场消减虾类TM过敏原的内在机制提供了理论支撑,为甲壳类水产品过敏原的消除提供了新的思路和解决方案。主要研究结果如下:（1）TM抗原表位的空间模拟、筛选及关键氨基酸分析。采用Hopp-Woods、Kyte-Doolittle、Emini-surface Probability等算法预测并筛选得到中国对虾TM的12条抗原表位,通过SWISS-MODEL对中国对虾TM氨基酸序列分析、同源建模和可视化分析构建出TM和12条抗原表位的空间构象。另外,通过Fmoc方法合成得到12条抗原表位,鉴定其纯度、验证其分子量,并通过Ic-ELISA对合成的12条抗原表位进行筛选确定肽7（T7:LENRSLSDEERMDALENQ）和肽12（T12:DRLEDELVNEKEKYKSITDE）为致敏性最高的两条肽段;丙氨酸（Ala）、精氨酸（Arg）、天冬酰胺（Asn）、谷氨酸（Glu）、组氨酸（His）、丝氨酸（Ser）以及酪氨酸（Tyr）被预测为潜在的关键致敏性氨基酸。（2）CP处理对TM关键抗原表位的结构和IgE/IgG结合能力影响分析。T7和T12的IgE/IgG结合能力随着CP处理时间（0-9 min）的延长逐渐上升,处理时间大于9 min后,T7和T12的IgE结合能力分别下降了9.97%和19.50%,其IgG结合能力分别下降了20.84%,21.99%。圆二色谱中的二级结构含量变化图表明,T7和T12经CP处理后α-螺旋、β-转角以及β-折叠含量几乎没有变化,但无规卷曲的含量均高于其他二级结构。紫外光谱结果表明,T7在0-9 min内紫外吸收升高,9-15 min内紫外吸收降低;而T12在0-6 min内紫外吸收升高,9 min紫外吸收降低,9-15 min后又升高。内源荧光光谱结果表明,两条多肽的内源荧光强度经CP处理0-9 min均呈现下降趋势,经CP处理9-12min荧光略有升高。紫外光谱和内源荧光光谱结果均表明CP处理改变了多肽的空间构象。（3）CP处理过程中主要活性粒子对TM抗原表位关键氨基酸致敏性的影响分析。自由基屏蔽剂处理结果表明,CP介导的氧化微环境中的主要活性粒子对T7的IgE结合能力的贡献值为·O（10.54%）＞e-（aq）（6.98%）＞·OH（5.99%）;而对T12的IgE结合能力的贡献值为·O（33.47%）＞e-（aq）（10.43%）＞·OH（1.50%）。分子对接结果表明,T7与CP介导的氧化微环境中的活性粒子NO3-、NO2-连接的位点均为Glu131和Arg133;T12与NO2-连接的位点为Asp254、Leu256及Glu257,T12与NO3-连接的位点为Asp254、Arg255和Leu256,结合氨基酸频率分析结果,Glu131、Arg133、Arg255和Glu257均可作为突变的位点。氨基酸突变和Ic-ELISA结果表明,T7中Glu131和Arg133以及T12中Arg255为引起致敏性的最为关键的氨基酸。
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