[背景]青光眼(glaucoma)是一组以特征性视神经萎缩和视野缺损为共同特征的疾病,病理性眼压增高是其危险因素,其中最核心的问题是青光眼性视神经病变。作为继白内障之后全球第二位致盲眼病,青光眼严重威胁着人类的视觉健康。因为一些体内、外不良因素的诱导或刺激造成眼压的升高或大幅度波动,如果眼压的变化超过了眼球内组织,尤其是视网膜视神经所能承受的限度,将给眼内组织尤其是视神经及其视觉通路和视觉功能带来损害,最典型和最突出的表现是视盘的凹陷性萎缩和视野的特征性缺损缩小。如不及时采取有效的治疗,视野可以全部丧失终至失明。青光眼视神经损害临床上表现为特征性的视神经萎缩,是神经节细胞轴突变性的直接表现,所有类型青光眼的主要病理学特征都是视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells,RGCs)的死亡。长期以来青光眼的发病机制可以归纳为两大类:机械压力学说和血管缺血学说。机械压力学说强调眼压作用,认为眼压升高引起筛板各层变形移位产生剪切力,使视网膜神经节细胞(RGCs)轴浆流阻滞于筛板区,轴突蛋白的生成和转运减少阻碍了脑源性神经营养因子的获得,最终导致RGCs凋亡。而血管缺血学说认为,由于各种原因引起视乳头微循环障碍,导致视乳头及其周围组织营养物质供应减少,RGCs轴突即视神经纤维缺血缺氧并最终凋亡。由于RGCs破坏后不能再生,RGCs的死亡将导致视力的永久性丧失。临床上青光眼的治疗主要采用降眼压类药物或手术方式,其主要目的在于控制眼压,然而部份患者虽然眼压控制良好,但视野仍然出现进行性丢失并最终导致盲。由此可见单纯的降低眼压并非能完全控制青光眼患者RGCs的丢失。随着对青光眼视神经损伤机制和病理生理过程的深入研究及认识,在临床治疗中尽早的采取抑制RGCs死亡,促进神经修复和视神经保护的治疗措施,成为改善视神经病变患者视力的重要途径,得到了临床医生的高度重视,已成为目前视神经保护研究的重点及难点。阿克苷(C29H36015)是苯丙素总苷的主要成分,来源于云南苦丁茶。本课题组前期研究发现,阿克苷对损伤模型RGCs具有保护作用。在大鼠慢性高眼压模型和视神经钳夹伤模型中,给予阿克苷治疗后,RGCs数量较对照组有明显的增加,同时RGCs特异性标志物Thy-1的表达水平也显著高于对照组,证明了阿克苷可以减少RGCs凋亡。在大鼠视网膜再灌注损伤模型中,阿克苷能促进细胞形态恢复,减少RGCs凋亡,减轻视网膜缺血再灌注损伤。为了进一步研究阿克苷对RGCs的保护作用,我们发现缺血再灌注损伤后阿克苷显著下调RGCs的LC3和Beclin-1的表达,上调p62蛋白表达。同时,应用阿克苷联合自噬抑制剂3MA作用于RGCs细胞,发现阿克苷可以下调OPTN的表达并抑制LC3的表达,而自噬激动剂雷帕霉素(Rampamycin)可以上调OPTN的表达。说明阿克苷可能通过下调OPTN自噬受体从而抑制自噬。但阿克苷是怎样通过OPTN调控RGCs细胞的自噬?有待进一步研究。[目的]在体外水平探究阿克苷调控细胞自噬对视网膜神经节细胞RGC-5的保护作用,及其分子机制。[方法]1、体外培养RGC-5细胞,采用浓度梯度的CoCl2处理,构建RGC-5细胞氧化应激损伤模型。用0、10、20、40、80、160、320 μmol/L的CoCl2处理细胞,探索构建损伤细胞模型的合适浓度。采用高中低三种不同浓度的阿克苷处理氧化应激损伤的RGC-5细胞,检测阿克苷对CoCl2损伤的RGC-5细胞的保护作用。2、应用CCK-8、透射电镜及流式细胞仪检测阿克苷对RGC-5细胞增殖、自噬和凋亡的作用。3、Affymetrix microRNA表达谱芯片检测阿克苷促进RGC-5细胞损伤修复过程中miRNA的差异表达。将冻存细胞从液氮中取出后,在37℃水浴锅内不断摇动促进其融化。经离心、清洗、接种并放于培养箱中培养。当传代培养使用时清洗后以吸管上下吸放数次以打散细胞团块,混和均匀后,补足3n(n为传代瓶数)ml培养基(MEM),依稀释比例转移至新的培养瓶中,并放入CO2培养箱培养。按照Affymetrix microRNA表达谱芯片提供的杂交操作流程采用相应的杂交Gene Chip Hybridization Wash and Stain Kit试剂盒对RNA样品和芯片进行杂交结合,根据试剂盒操作说明;配制杂交反应液,加入到上述生物素标记的样品中;采用Gene Chip-Scanner-3000 进行结果扫描,以及 GeneChip Command Console Software5.0读取结果。4、差异miRNA(miR-342-3p)与其靶基因OPTN的靶向作用关系检测。应用双荧光素酶报告基因检测miR-342-3p与OPTN的靶向作用。构建用于双荧光检测的野生型和突变型OPTN重组质粒(pmirGLO-OPTN-WT/MUT),与miR-342-3p mimics共转染到HEK293T细胞,对照组用miR-342-3p scramble阴性对照与OPTN的野生型或突变型重组质粒共转染。按荧光素酶活性检测试剂盒(Promega)操作说明,检测荧光相对强度。5、miRNA-342-3p与OPTN的过表达或敲降转染。采用miR-342-3p mimic或inhibitor对miRNA-342-3p进行过表达或敲降转染;采用pcDNA3.1-OPTN重组质粒或OPTN敲降序列sh-RNA-OPTN对OPTN进行过表达或敲降转染。其中,miR-342-3p的过表达或敲降转染以miR-scramble为对照;OPTN的过表达转染以空载质粒作为对照,敲降转染以nonsence shRNA转染作为对照;每组转染实验组设置NC对照,每个实验组设3个复孔。6、应用 qRT-PCR、Western blotting 检测 RGC-5 细胞中 miR-342-3p 与 OPTN 表达的影响。离心后收集各组细胞,采用Trizol法裂解和抽提各组RRGC-5细胞的中的总RNA。应用逆转录试剂盒进行逆转录,并采用SYBR Green Master Mix实时荧光定量PCR试剂盒进行相对表达检测。应用Western blotting检测阿克苷对RGC-5细胞中OPTN的表达情况。7、应用Western blot实验和免疫荧光实验和检测RGC-5细胞中PI3K/AKT/mTOR通路及自噬相关蛋白表达的影响。提取细胞总蛋白,SDS-PAGE凝胶电泳,Western blot反应检测RGC-5中PI3K/AKT信号通路及自噬相关蛋白(Beclin-1、Soluble-p62、Insoluble-p62、LC3-Ⅰ/Ⅱ)、细胞凋亡相关蛋白(caspase3 和 caspase7)等的表达。制备细胞爬片,4%多聚甲醛固定,免疫荧光检测自噬标志Beclin-1、LC3Ⅱ的表达。[结果]1、阿克苷对RGC-5细胞损伤的保护作用。用30μmol/L的CoCl2干预RGC-5细胞24h构建RGC细胞损伤模型显著抑制了 RGC细胞的增殖活力,促进细胞的凋亡水平。电镜检测结果表明,CoCl2损伤组RGC-5细胞的自噬水平显著升高,自噬小体的含量显著高于正常细胞组,Westernblot和免疫荧光检测结果表明,损伤组细胞Beclin-1的表达显著上调,可溶性p62蛋白显著升高,不可溶性p62明显降低,Ⅱ型LC3蛋白的转化也显著高于对照组。三组浓度的阿克苷处理均显著促进了 RGC-5细胞增殖活力、降低了细胞损伤后的自噬和凋亡水平。2、阿克苷显著上调RGC-5细胞中miR-342-3p的表达。microRNA Array 4.0芯片,对正常对照组、CoCl2损伤组、阿克苷处理组RGC-5细胞进行miRNAs表达分析结果表明,阿克苷组RGC-5细胞有64个miRNAs差异表达,上调的miRNAs有41个,上调倍数最大的是miR-342-3p,上调倍数为4.65。3、敲降miR-342-3p显著降低了阿克苷对RGC-5细胞的保护作用。与阿克苷组相比,阿克苷+敲降miR-342-3p组显著降低了 RGC-5细胞的增殖活力促进了 RGC-5细胞的自噬和凋亡水平。免疫荧光和Western Blot检测自噬相关蛋白发现敲降miR-342-3p组RGC细胞Beclin-1的表达显著上调,可溶性p62蛋白显著升高,不可溶性p62明显降低,Ⅱ型LC3蛋白的转化水平升高。4、miR-342-3p靶向负调控OPTN的靶向作用。starBase数据库的预测结果表明,OPTN可能是miR-342-3p的靶基因。双荧光素酶报告基因实验结果表明,OPTN野生型载体中,对照组与miR-342-3pmimics组RGC-5细胞的荧光素酶活性分别为 10.044±0.462、4.820±0.284(t=5.685,P=0.008);而 OPTN 突变型载体中,对照组与miR-342-3p mimics组RGC-5细胞的荧光素酶活性分别为10.015±0.439、9.957±0.514(t=0.402,P=0.859)。5、阿克苷通过miR-342-3p/OPTN分子轴调控RGC-5细胞增殖、自噬及凋亡。与损伤模型组(NC组)RGC-5细胞相比,过表达OPTN组RGC-5细胞的增殖活力受到显著抑制、细胞的凋亡和自噬水平进一步显著升高;与阿克苷组相比,阿克苷+过表达OPTN组显著降低了阿克苷对损伤细胞的保护作用,阿克苷+过表达miR-342-3p+过表达OPTN组与阿克苷组的检测结果在细胞增殖活力、凋亡和自噬方面无明显差异。6、阿克苷通过激活PI3K/AKT/mTOR通路抑制RGC-5细胞自噬。Western blot结果显示,阿克苷或3-MA均能够单独同时激活PI3K和AKT,进而导致RGC-5细胞的自噬受到抑制。阿克甙处理显著降低了雷帕霉素诱导的细胞自噬。并且阿克苷与自噬抑制剂3-MA共同联用对细胞中自噬体的数量的降低作用与单独使用相比,具有更强的效果。7、阿克苷通过OPTN与PI3K/AKT/mTOR通路的协同作用抑制RGC-5细胞自噬而降低RGC-5细胞凋亡水平。[结论]1.阿克苷促进损伤的RGC-5细胞增殖,抑制RGC-5损伤导致的细胞自噬和凋亡2.阿克苷显著促进损伤的RGC-5中miR-342-3p的表达。3.阿克苷通过上调miR-342-3p/OPTN分子轴促进RGC-5细胞增殖,抑制细胞自噬及凋亡。4.阿克苷通过激活PI3K/AKT信号通路降低RGC-5细胞的自噬和凋亡。5.阿克苷通过促进OPTN和PI3K/AKT信号通路的协同作用,实现对RGC-5细胞的保护作用。