【摘 要】
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目的:环形非编码RNA CircRNA＿005647对心肌纤维化的调控作用及机制不清楚,本文探讨CircRNA＿005647对心肌纤维化调控作用的分子机制。方法:1.利用血管紧张素Ⅱ（Ang-Ⅱ）缓释泵（1.46mg/kg/day,2周）灌注C57BL/6小鼠构建心肌纤维化动物模型,检测小鼠心肌中CircRNA＿005647及其宿主基因Myo9a、纤维化相关基因（Colla1、Col3al、ACT
【基金项目】
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国家自然科学基金面上项目（编号:81770264）；
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目的:环形非编码RNA CircRNA＿005647对心肌纤维化的调控作用及机制不清楚,本文探讨CircRNA＿005647对心肌纤维化调控作用的分子机制。方法:1.利用血管紧张素Ⅱ（Ang-Ⅱ）缓释泵（1.46mg/kg/day,2周）灌注C57BL/6小鼠构建心肌纤维化动物模型,检测小鼠心肌中CircRNA＿005647及其宿主基因Myo9a、纤维化相关基因（Colla1、Col3al、ACTA2）的表达水平。2.分离、培养C57BL/6小鼠原代心肌成纤维细胞（cardiac fibroblasts,CFs）。3.利用腺病毒介导在小鼠CFs中过表达CircRNA＿005647,通过RT-qPCR和Western blot检测小鼠CFs中纤维化相关基因表达水平。4.通过CCK8、EDU和Transwell实验检测CircRNA＿005647对小鼠成纤维细胞增殖和迁移能力的影响。5.通过双荧光素酶报告试验鉴定CircRNA＿005647与miR-27b-3p的结合作用。6.通过RNA 反义纯化技术（RNA antisense purification,RAP）和 RNA Pull-down 实验进一步验证CircRNA＿005647与miR-27b-3p的结合作用。7.双荧光素酶报告基因实验鉴定miR-27b-3p与潜在靶基因过氧化物酶体增殖物激活受体-γ亚基基因（peroxisome proliferator-activated receptor gamma,PPAR-y,Pparg）3’-UTR 的结合作用。8.利用RT-qPCR和Western blot检测分别转染Pparg siRNA和miR-27b-3p的小鼠CFs中细胞纤维化相关基因表达。9.利用腺病毒介导在小鼠CFs中过表达PPAR-y,检测对纤维化相关基因表达的影响。10.验证miR-27b-3p参与Circ＿005647对心肌纤维化相关基因表达的调控作用。11.检测Circ＿005647对miR-27b-3p 靶基因Pparg表达的调节作用。结果:1.Masson染色结果显示,成功建立Ang-Ⅱ诱导的小鼠心肌纤维化模型,Ang-Ⅱ灌注诱导小鼠发生显著的心肌纤维化,心肌纤维化相关的Col1a1、Col3a1和ACTA2表达显著升高,同时Circ＿005647和Myo9a表达上调。2.Ang-Ⅱ诱导的 CFs 模型,RT-qPCR结果显示 Col1a1、Col3a1、ACTA2、Circ＿005647和Myo9a均一致性表达上调。3.过表达Circ＿005647能显著抑制小鼠CFs中纤维化相关基因表达。4.CCK8、EDU和Transwell结果显示CircRNA＿005647对小鼠CFs增殖、迁移无明显作用。5.证实miR-27b-3p是Circ＿005647作用靶基因,过表达Circ＿005647可以下调小鼠CFs中miR-27b-3p的表达。6.证实Pparg是miR-27b-3p作用靶基因,miR-27b-3p可在转录水平抑制Pparg的表达。7.沉默Pparg和过表达miR-27b-3p能够一致地增强CFs中纤维化相关基因表达水平。8.miR-27b-3p参与Circ＿005647对小鼠CFs中纤维化相关基因表达的调控作用,miR-27b-3p靶基因Pparg介导Circ＿005647抑制小鼠CFs中纤维化相关基因表达。结论:1.成功建立Ang-Ⅱ诱导的小鼠心肌纤维化模型,Circ＿005647和Myo9a在纤维化小鼠心肌中表达显著性增加。2.Ang-Ⅱ诱导的心肌纤维化细胞模型中,Circ＿005647 和 Myo9a 表达显著上调。3.证实 miR-27b-3p 与 Circ＿005647间存在结合作用。4.Pparg是miR-27b-3p作用靶基因,PPAR-γ介导miR-27b-3p促进小鼠CFs中纤维化相关基因表达。5.Circ＿005647能抑制小鼠CFs中miR-27b-3p表达,PPAR-γ介导Circ 005647发挥抑制小鼠心肌纤维化的作用。
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