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蛋白激酶C(Protein Kinase C, PKC)是一组丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族。PKC传导来自细胞外的大量受体信号,在多种生理和病理过程中起重要作用。近年来研究发现PKC可能成为肿瘤治疗的靶点。PKCβ由N-末端的调控区和C-末端的催化区组成的单一多肽,分子量为80kDa; PKCβ基因选择性剪切产生两种蛋白PKCβⅠ和PKCβⅡ,仅在C-末端V5区的50或52个氨基酸不同。PKCβ参与实体瘤和血液系统肿瘤的发生发展,如结肠癌、乳腺癌、肺癌和白血病等。PKCp参与多条肿瘤相关的信号通路,如MAPK、GSK3β和AKT等信号通路的转导。本论文通过将PKCβⅠ和PKCβⅡ基因转染入小鼠成纤维细胞NIH-3T3,经过筛选鉴定,建立了稳定高表达PKCβⅠ和PKCβⅡ的小鼠成纤维细胞株,分别命名为NIH-3T3/PKCβⅠ和NIH-3T3/PKCβⅡ。研究发现PKCβⅡ使NIH-3T3细胞变小,生长加快,软琼脂集落形成能力增加；PKCβⅡ促进肿瘤较早形成,肿瘤体积较大；而PKCβⅠ对NIH-3T3细胞的形态与增殖无明显影响；PKCβⅠ和PKCβⅡ均使NIH-3T3细胞G1期比例增加,划痕愈合能力、细胞粘附能力增强；PKCβⅠ使NIH-3T3细胞穿过人工基底膜能力下降,而PKCβⅡ使侵袭能力增强,但两者对NIH-3T3细胞分泌MMPs能力均没有影响。上述生物学的改变与PKCp下游ERK、GSK3β信号通路的激活有关。上述这些结果提示PKCβⅡ在肿瘤细胞增殖、侵袭转移中起着重要作用。采用Western blot方法检测了一系列肿瘤细胞中PKCβⅠ和PKCβⅡ的表达,发现两者均在人慢性髓性白血病K562细胞中表达较高,尤其以PKCβⅡ蛋白表达更明显。因此采用RNAi方法进一步研究了PKCβⅡ对肿瘤细胞增殖能力的影响。研究发现,与空载体细胞比较,稳定沉默PKCβⅡ使K562细胞生长速度减慢,软琼脂集落形成能力下降,G1期细胞比例略增加；稳定沉默PKCβⅡ使K562细胞中p-ERK和p-GSK3β表达较低,而p-p38和p-AKT的表达显著增加。这些结果提示,PKCβⅡ在K562细胞增殖中起重要作用。这与PKCp下游的ERK和GSK3p通路有关。总之,本文成功地建立了稳定高表达PKCβⅠ和PKCβⅡ的小鼠成纤维细胞的筛选模型,PKCβⅡ与肿瘤发生发展密切相关,其下游的优势通路为ERK和GSK3β信号通路。PKC参与多种信号转导通路,包括细胞增殖、分化、凋亡和血管形成等。佛波酯类促癌剂如PMA能代替DAG等第二信使在体外直接激活PKC,导致特殊的细胞功能被激活或无法控制的细胞增殖,使PKC有可能成为肿瘤治疗的靶点。根据作用机制PKC抑制剂分为3类,目前研究较多的双吲哚马来酰亚胺类化合物Enzastaurin是作用于ATP结合位点的PKCp抑制剂,具有较好的抑制肿瘤细胞增殖和血管形成的作用。为了开发新型的PKCβ抑制剂,本所化学合成室刘站柱研究员课题组合成了一系列新型双吲哚马来酰亚胺类衍生物,经过MTT法初筛它们的抗肿瘤活性,发现WK234具有较好的抑制作用,对人慢性髓性白血病K562细胞作用最明显。同时我们发现PKCβⅠ和PKCβⅡ蛋白在K562细胞中表达均较高。基于上述研究结果,本文对WK234抗慢性髓细胞性白血病的作用及机制进行研究。本实验研究发现WK234对K562细胞体外增殖有明显抑制作用,作用24 h的IC50为52.16μmol/L,48 h的ICso为27.26μmol/L,72 h的IC50为14.71gmol/L,呈较好的剂量和时间依赖性。15μmol/LWK234较好地抑制K562细胞的生长,降低其软琼脂集落形成能力,使K562细胞阻滞在G2/M期,随着剂量的增加和时间的延长加能诱导细胞凋亡；能使K562细胞凋亡相关蛋白Bax表达增加,Bcl-xL表达降低,Cytochrome C和断裂的Caspase-3表达增加,提示可能通过线粒体途径诱导细胞凋亡。WK234在作用2h时,显著抑制K562细胞中PKCβⅠ、p-PKCβⅠ(Thr642)蛋白的表达；在4h时,显著降低PKCβⅠ、p-PKCβⅡ(Ser660)蛋白的表达。同时WK234能降低PKCβ信号通路p-GSK3α/β、p-ERK的表达,但可增加p-p38和p-AKT蛋白的表达。WK234能抑制细胞膜上PMA诱导的磷酸化PKCβⅡ(Ser660)蛋白的表达,增加其在细胞浆和细胞核内的表达。这些结果提示WK234通过降低PKCβ及下游信号通路蛋白的表达来抑制K562细胞的增殖,通过线粒体途径诱导K562细胞凋亡而发挥抗慢性髓性白血病作用。综上所述,WK234明显抑制慢性髓性白血病K562细胞增及诱导细胞凋亡,其机制通过线粒体途径诱导细胞凋亡及抑制PKCβ和下游ERK、GSK3β信号通路蛋白的表达有关。