论文部分内容阅读
目的:1.观察寻常型银屑病患者外周血T淋巴细胞分布情况。2.观察不同浓度银屑Ⅰ号含药血清对细胞因子IL-4、IL-6、IL-17、IL-23、INF-γ、TNF-α、TGF-β、25HVD3(VD)的浓度以及VDR和STAT4蛋白与基因表达水平的影响,从分子水平阐述银屑Ⅰ号方治疗银屑病的作用靶点,探讨药物的作用机制,为中药复方的现代化与推广提供更有据的基础研究。3.探讨VDR信号网络与STAT信号通路的作用机制,明确银屑Ⅰ号含药血清通过干预维生素D受体(vitamine D recepter)、调控STAT信号通路来调节银屑病免疫失衡状态,以初步阐明银屑Ⅰ号治疗寻常型银屑病的作用机制,为银屑Ⅰ号的临床推广阐明基础。方法:从广州中医药大学第一附属医院皮肤科门诊就诊患者中,筛选寻常型银屑病患者80例,需诊断为寻常型银屑病,符合纳入和排除标准,经签署知情同意书后,根据银屑病皮损面积及严重程度评价标准行银屑病面积及严重程度指数(Psoriasis Area and Severity Index,PASI)进行评分,抽取每位患者外周静脉血10ml,分离提取T淋巴细胞,分别用低、中、高不同浓度的银屑1号含药血清进行培养,并设正常对照组(空白干预)和阳性对照组(雷公藤甲素干预)对照,观察培养上清液T淋巴细胞亚型CD3+CD4+、CD3+CD8+分布;同时采用成熟的分子生物学技术酶联免疫吸附测定法(enzyme-linked immuno sorbent assy,ELISA)、采用反转录酶-聚合酶链锁反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)、以及蛋白印迹法(Western blot,WB)观测银屑病细胞模型中IL-4、IL-6、IL-17、IL-23、INF-γ、TNF-α、TGF-β、25HVD3(VD)的浓度变化,比较VDR与STAT4蛋白与基因的表达水平,免疫荧光双标检测各组T淋巴细胞中VDR与STAT4荧光强度,最后进行数据对比统计分析。结果:1.对外周血T淋巴细胞分布的影响不同浓度含药血清对人外周血T淋巴细胞的表达均有不同,与正常对照组相比,中药低、中、高剂量组以及阳性对照组CD3+CD4+分布比值明显升高(P<0.01);中药各组CD3+CD4+比例随药物浓度增加呈明显上升趋势(P<0.01),CD3+CD8+比例有所升高,但波动幅度明显低于CD3+CD4+上升幅度,中药组组间对比CD3+CD4+、CD3+CD8+表达差异性明显(P<0.01);各组CD4/CD8比值均小于1,中药低、中、高剂量组CD4/CD8比值呈梯度升高(P<0.01)。2.对细胞因子IL-4、IL-6、IL-17、IL-23、INF-γ、TNF-α、TGF-β、VD的浓度的影响与正常对照组相比,中药低、中、高剂量组以及阳性对照组细胞因子IL-6、IL-17、IL-23、INF-γ、TNF-α、VD浓度均明显降低(P<0.01),以中药高剂量组和阳性对照组降低幅度最为明显;与阳性对照组相比,中药低、中剂量组IL-6、IL-17、IL-23、INF-γ、TNF-α、VD浓度明显升高(P<0.01),中药高剂量组变化无统计学意义(P>0.05);中药各组组间比较,中药低剂量组>中药中剂量组>中药高剂量组,呈明显梯度差异(P<0.01),以中药高剂量组效果最优。与正常对照组相比,中药低、中、高剂量组和阳性对照组IL-4、TGF-β浓度明显升高(P<0.01),其中中药高剂量组与阳性对照组升高最为明显;与阳性对照组比较,中药低、中剂量组IL-4、TGF-β浓度明显下降(P<0.01),中药高剂量组浓度无明显下降,无统计学差异(P>0.05);中药各组组间相比,呈明显梯度差异(P<0.01),以中药高剂量组效果最优。3.对VDR与STAT4蛋白浓度和基因表达的影响VDR蛋白表达比较发现:与正常对照组比较,中药低、中、高剂量组以及阳性对照组VDR蛋白表达明显升高(P<0.01);与阳性对照组比较,中药低、中剂量组VDR表达明显下降(P<0.01),中药高剂量组与阳性对照组相比较无明显差异性(P>0.05)。各组STAT4蛋白表达比较发现:与正常对照组比较,同样中药低、中、高剂量组以及阳性对照组STAT4蛋白表达明显下降(P<0.01);与阳性对照组比较,中药低、中剂量组STAT4表达明显上升(P<0.01),中药高剂量组STAT4表达上升(P<0.05)。VDRmRNA表达水平比较发现:与正常对照组相比较,中药低、中、高剂量组和阳性对照组VDRmRNA表达水平明显升高(P<0.01);与阳性对照组比较,中药低、中剂量组VDRmRNA表达水平明显下降(P<0.01),中药高剂量组与阳性对照组相比较无明显差异性(P>0.05);中药各组间比较有显著性差异(P<0.01)。各组STAT4mRNA表达水平比较发现:与正常对照组相比较,中药低、中、高剂量组和阳性对照组STAT4mRNA表达水平明显降低(P<0.01);与阳性对照组比较,中药低、中剂量组STAT4mRNA表达水平明显升高(P<0.01),中药高剂量组基因表达水平无明显差异(P>0.05);中药各组间比较差异呈梯度改变且有统计学意义(P<0.01)。结论:银屑Ⅰ号可以下调银屑病细胞模型中细胞因子IL-6、IL-17、IL-23、INF-γ、TNF-α、VD的浓度,可促进IL-4、TGF-β的表达,在上调VDR蛋白及基因的表达的同时抑制STAT4蛋白及基因的表达,且通过中药不同浓度含药血清组别间比较,可表现出一定的剂量依赖性,即药物浓度越高,对炎性因子的抑制作用也越明显,对VDR信号的促表达作用越明显,而与STAT4信号通路则有一定的的负相关性。说明银屑Ⅰ号具有明显的炎症抑制作用,其作用机制可能与调控VDR信号网络以及STAT4信号表达水平有关。