牛双芽巴贝斯虫(Babesia bigemina)是一种对牛危害极大的血液寄生虫,临床上多以发热、贫血、黄疽、血红蛋白尿和死亡为主要特征[1]。本病以微小牛蜱等为主要传播者,一旦传入,极难彻底消灭,还可经胎盘垂直传播[2]。因此发病牧场在短期内不易变为安全牧场,严重威胁着畜牧业的发展。目前显微镜观察法仍是我国基层兽医诊断该病的主要方法。血液涂片中发现虫体是确诊的必要条件之一[3,4]。而牛双芽巴贝斯虫的虫体形态随病程的发展而有所变化,这给诊断带来了一些困难。因此有必要建立一套方便、准确、廉价的血清学诊断体系来及时发现和确诊该病。本研究主要包括以下三部分:1牛双芽巴贝斯虫热休克蛋白HSP20基因的克隆牛双芽巴贝斯虫HSP20基因全长699bp,含有一个内含子,编码一个分子量为20KDa的蛋白质。从患病牛全血总基因组中,PCR克隆该基因,构建亚克隆载体,然后测序检验。克隆的HSP20基因存在四处突变,其中第120bp处的突变(A变为G)和第191bp处的突变(T变为C)位于内含子区,没有引起氨基酸序列的改变。第582bp处的突变(G变为C)为同义突变,只有第643bp处的突变(A变为G)使其编码的氨基酸由苏氨酸突变为缬氨酸。2牛双芽巴贝斯虫HSP20基因的原核表达及其免疫反应性研究从患病牛的全血样品中抽提总RNA,经RT-PCR扩增得到HSP20基因的外显子,将其插入到质粒pGEX-4T-2中,成功构建原核表达质粒pGEX-4T-HSP20(exon),并在E.coli BL21(DE3)中得到高效表达。3牛双芽巴贝斯虫HSP20基因的真核瞬时表达及其免疫反应性研究将克隆得到的HSP20基因插入真核表达质粒pcDNA3.1(+)中,构建真核表达载体pcDNA3.1(+)-HSP20。测序鉴定后,尾静脉注射小鼠进行HSP20基因的瞬时表达,取其肝脏提取总RNA,经RT-PCR方法扩增出一条534bp的目的条带,表明真核表达载体构建成功。用该质粒免疫小鼠,能激发小鼠产生敏感的中和抗体。本研究成功克隆表达了牛双芽巴贝斯虫HSP20基因,纯化得到了具有很强生物活性的重组蛋白,为建立相应的ELISA诊断试剂盒提供了可能。