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第一部分脂多糖加重α-synucein基因突变小鼠多巴胺能神经元损伤机制的研究帕金森氏病(Parkinson’s disease,PD)是由遗传和炎症等多种病因引起的神经退行性疾病。有多种可模拟PD发病的动物模型,α-synuclein(A53T)转基因小鼠和脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)腹腔注射小鼠分别从基因突变和炎症角度模拟PD的病理改变,但这些模型仅模拟PD发病的单一因素,且出现病理改变的时间较长。本实验采用LPS注射α-synuclein转基因小鼠建立炎症和遗传因素双重打击的PD模型。结果显示LPS联合α-synuclein转基因刺激可导致小鼠转棍和爬杆运动协调功能障碍,黑质中酪氨酸羟化酶(TH)阳性神经元数量明显降低,中脑TH的表达明显下降,纹状体中多巴胺含量显著降低,出现多巴胺能神经元功能低下的表现,以上行为学和病理改变均较二者单独刺激明显加重,表明联合刺激可加重模型损伤,表现出协同效应。机制研究发现LPS联合α-synuclein可引起明显的神经炎症和神经元凋亡,表现为小胶质细胞活化标志物Ibal表达增加以及与凋亡相关的Bcl2/BaxL比值下降,细胞凋亡执行的关键分子caspase-3活性升高。差异蛋白质组学研究发现LPS和α-synuclein双重打击可导致小鼠脑中与炎症和凋亡相关蛋白CD99抗原样蛋白2(CD99L2)和细胞色素c氧化酶7A相关蛋白(COX7RP)的表达明显增加,提示这两种蛋白可能参与PD的发病过程,它们在PD发病中的作用机制有待于进一步研究探讨。以上研究表明在基因突变基础上引入炎症刺激可建立更理想的PD动物模型。第二部分:FLZ通过Src/PTEN/Akt信号通路抑制神经炎症的机制研究帕金森氏病(Parkinson’s disease,PD)的发病与神经炎症密切相关,小胶质细胞过度激活后可释放细胞因子、化学因子和兴奋性氨基酸等损伤周围神经元,导致神经元死亡和丢失。研究发现抑制小胶质细胞过度活化引起的神经炎症对PD有改善作用,因此抑制神经炎症可能是治疗PD的新策略。FLZ是番荔枝酰胺衍生物,临床前研究表明FLZ具有治疗PD的作用,现已进入I期临床研究。FLZ治疗PD的作用与其抑制神经炎症而保护多巴胺能神经元有关,但具体抗炎机制尚不不十分明确。因此,本研究采用LPS诱发的小胶质细胞神经炎症模型探讨FLZ抑制神经炎症的相关机制。结果显示在LPS刺激的BV2细胞中,FLZ可明显降低PTEN和Akt的磷酸化水平,PTEN的低磷酸化状态促使其由胞浆向胞膜转位,从而提高PTEN磷脂酶活性,促进PIP3分解为PIP2,导致Akt活性下降。当用VOOH(pic)抑制PTEN活性后,FLZ对TNF-α的释放量与LPS+VOOH(pic)组相比无明显降低,表明PTEN可能在FLZ抑制炎症中起着重要的作用。研究发现Src酪氨酸激酶是炎症的重要调控蛋白,可调控PTEN的活性。本研究发现FLZ可明显抑制Src和PTEN的相互作用。当抑制Src后FLZ对PTEN的磷酸化水平无明显影响,过表达Src后FLZ可明显降低PTEN磷酸化水平,而抑制PTEN后FLZ仍可明显降低Src磷酸化水平,表明Src在FLZ抗炎效应中发挥重要作用,可能是PTEN的上游调控蛋白。进一步研究发现与LPS组相比,沉默Src后FLZ对Akt的磷酸化、TNF-α的释放以及iNOS和COX-2的表达均无明显影响,而过表达Src后与LPS组相比FLZ可显著降低Akt的磷酸化、TNF-α的释放以及iNOS和COX-2的表达,表明Src在FLZ抑制神经炎症中起着重要作用。进一步的分子对接研究表明,FLZ与Src之间存在相互作用,FLZ自身的H、O原子和苯环可与位于SrcN-端的Glu280和C-端的Ala293侧链之间形成的活性口袋相结合。以上结果表明Src酪氨酸激酶可能是FLZ抑制神经炎症的重要分子靶点,FLZ通过抑制Src/PTEN/Akt信号通路而实现其抑制神经炎症作用,这为FLZ临床治疗PD提供理论依据。