结核病是由结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis,Mtb）感染引起的一种严重的消耗性传染病,迄今已成为仅次于艾滋病的第二大致死性疾病。近年来,由于耐药Mtb的出现、其与艾滋病毒共感染,加之目前仍然缺乏更为有效的预防结核病的疫苗,使该病的防控陷入极大的困境。究其原因,主要是由于Mtb本身的复杂性造成的:Mtb为可寄生于宿主巨噬细胞的胞内寄生菌,能够逃避宿主免疫防御的杀伤,导致在宿主细胞中长期存在,从而形成慢性结核病的潜伏感染。因此,迫切需要明确Mtb免疫逃逸和引起机体持续感染机制,以寻找有效预防和治疗Mtb感染的新手段。Mtb具有特殊结构的脂质细胞包膜,不同于其他革兰氏阳性菌和阴性菌,这些脂质对于Mtb的生存力和致病性至关重要,因此与脂质合成代谢相关的酶被认为是Mtb关键的毒力因子。磷脂酶能够水解双分子磷脂层的膜结构,释放出游离脂肪酸和磷酸混合物,游离脂肪酸为Mtb在宿主细胞中生长和复制过程中提供了能量来源。因此,Mtb磷脂酶可能在破坏宿主细胞的膜结构（如:吞噬体膜结构）,尤其在Mtb巨噬细胞内适应和存活方面发挥重要作用。但是,目前对Mtb磷脂酶的研究多数还仅局限于活性鉴定和细胞毒性分析,并未对其机制进行深入研究,而磷脂酶是否有助于Mtb的免疫逃逸和持续感染更罕有报道。本研究首先通过检索保守氨基酸残基的生物信息学方法对Mtb基因组预测分析发现,rv3091编码的蛋白氨基酸序列中存在四个保守的Patatin-like磷脂酶结构域,并且在NCBI数据库中被描述为假定的Patatin-like磷脂酶蛋白超家族基因,提示Rv3091为Mtb的磷脂酶。随后,利用特异性引物从Mtb H37Rv基因组中克隆获得rv3091基因,构建分枝杆菌重组表达载体及重组耻垢分枝杆菌菌株（Ms3091）,从中表达纯化获得重组Rv3091蛋白。以硝基苯基酯、dioleoylphosphatidylcholine（DOPC）和dioleoylphosphatidylglycerol（DOPG）为底物,在是否存在抑制剂和真核辅助因子以及不同反应温度的条件下,应用分光光度法验证了其具有磷脂酶A1、磷脂酶A2和脂肪酶活性。并通过基因定点突变、蛋白表达纯化及活性分析,确定了其酶活性位点为Ser214和Asp407。后利用多克隆抗体结合Western blotting及质谱检测,明确Rv3091蛋白属于Mtb胞外蛋白,主要存在于分枝杆菌菌壁上,并且经异源过表达后可明显改变耻垢分枝杆菌的单菌落形态。经菌落计数发现Rv3091可显著增强耻垢分枝杆菌在小鼠腹腔巨噬细胞内的存活能力,进而通过透射电镜观察,Rv3091促进了耻垢分枝杆菌从吞噬体囊泡中逃逸,并增加了菌体对巨噬细胞的损伤。随后,经抗体阻断、免疫荧光和细胞外PLA活性分析证实,Rv3091多克隆抗体能够阻断Rv3091酶活性,从而降低重组耻垢分枝杆菌与吞噬溶酶体相关膜蛋白（LAMP-1）共定位,明确Rv3091的酶活性在促进耻垢分枝杆菌从巨噬细胞吞噬体逃逸过程中发挥重要作用。此外,经组织荷菌数和病理学切片分析,重组耻垢分枝杆菌滴鼻感染C57BL/6J小鼠后,Rv3091显著提高了菌体的存活率,促进了小鼠肺脏的炎症病理反应。综上所述,我们证实了 Rv3091是Mtb的一种细胞外Patatin-like磷脂酶,并阐明Rv3091通过促进耻垢分枝杆菌从巨噬细胞吞噬体中逃逸,从而提高其在宿主体内的存活率,最终达到菌体持续感染的致病机制,为结核病防控和开发新型抗结核病制剂奠定基础。