目的PTSD——创伤后应激障碍(posttraumatic stress disorder,PTSD)是对创伤等严重刺激因素的一种异常精神反应。是指由突发性、威胁性或灾难性生活事件导致个体延迟出现和长期持续存在的精神障碍,其临床表现以再度体验创伤为特征,并伴有情绪的易激惹和回避行为。现今因其发病率高、发病机制复杂等特点而备受关注。PTSD患者表现出海马体积缩小、血液中的皮质酮基础水平较低以及对应激反应性降低。另有研究报道,心理疾病患者出现糖皮质激素(glucoticold,GC)负反馈功能反常,发现严重抑郁症患者的GC反馈功能降低而PTSD患者的GC反馈功能增强。这些数据提示PTSD患者的下丘脑-垂体-肾上腺轴(hypothalamic-pituitary-adrenal axis,HPA-axis)功能反常。在GC反馈调节过程中可受到盐皮质激素受体(MinealocorticoidReceptor,MR)和糖皮质激素受体(Glucocorticoid Receptor,GR)的双重调节。在HPA轴中,这两种受体通过影响GC的负反馈而发挥重要作用。这两种受体与皮质酮的亲和力不同,MR是高亲和力和低容量的GC受体系统,而GR为低亲和力和高容量的GC受体系统。此外,两种受体在机体内的分布亦不同,MR主要分布于脑边缘结构内:如海马、杏仁核和额叶皮质细胞群,而GR广泛分布于所有脑区。推测两种受体可能在PTSD中行使不同的功能。研究发现了在精神障碍性疾病中MR和GR媒介效应的重要性,这些受体可调节与记忆、行为反应、害怕和恐惧相关的系统。MR是抑制HPA的重要控制因素,当机体受到应激后,MR与皮质酮结合的效应逐渐被GR所取代。因此,增加MR的容量可以降低对应激的神经内分泌反应。如抗抑郁药物可增加海马MR的表达以及降低HPA轴的基础活性和应激诱导活性,阻断MR和GR使机体产生焦虑和惊恐、MR拮抗剂可使恐惧增强。这些研究表明,海马MR和GR的变化能调节精神障碍疾病的行为和情绪变化。另一方面,过多的皮质醇激素或慢性缺失都使海马神经元发生改变,提示皮质醇激素受体是海马损伤的重要因素。研究报道,通过应用MR配体可以治疗突触功能的退化和丢失,因此MR和GR对海马神经元发生的效应暗示在PTSD中MR、GR均是改变海马结构和功能的重要因素。此外,临床检查也发现PTSD患者血中糖皮质激素水平低下的同时血中的促肾上腺皮质素释放激素(corticotropin releasing hormone,CRH)和精氨酸加压素(arginine vasopressin,AVP)浓度反而增高。下丘脑作为HPA轴中重要中枢部位,即决定着血中皮质酮的改变,同时也受到海马的负反馈抑制,因此海马功能的变化势必要影响下丘脑的改变,血中皮质醇浓度的变化也可能影响下丘脑的改变。并且MR在下丘脑中不受皮质醇的调节,提示下丘脑内MR不直接涉及HPA轴的功能。因此认为MR在中枢神经系统中具有双重角色,在海马MR调节皮质醇昼夜变化的基础水平,而在下丘脑中只影响盐皮质激素对盐离子吸收和调节血压。GR作为糖皮质激素效应的执行者,不仅参与机体的能量代谢,而且还对多种基因具有转录调控作用,并直接接受激素的反馈调节。此外,当机体受到应激刺激时,下丘脑室旁核(Paraventricular nucleus,PVN)的神经元分泌多种促进促肾上腺皮质激素(Adrenocorticotropic hormone,corticotropin,ACTH)分泌的激素,其中最常见的是CRH和AVP。这两种激素可进一步调节血中类固醇激素的水平。综上所述,海马富有MR和GR两种受体,MR和GR作为类固醇激素的受体,可调节PTSD患者血中类固醇激素水平,同时又能影响海马对下丘脑的作用。并且海马又是与记忆相关的结构,可见其结构和功能改变与PTSD的恐惧、麻木等精神症状表现有着必然的联系,因此海马与下丘脑是与PTSD的发病机制密切相关的部位。另外,文献报道:目前SPS(Single prolonged stress)方法能很好地反映PTSD的激素水平变化,是制作PTSD动物模型的理想方法,并且该方法已经被国际所确认。因此本研究采用SPS方法刺激大鼠使产生PTSD样改变,然后应用免疫组织化学技术、免疫双标技术和Western blotting技术研究SPS刺激后各时间段的海马、下丘脑内MR和GR的表达以及下丘脑内CRH和AVP的表达,探讨海马与HPA的相互影响,为揭示PTSD的发病机制和临床表现的研究提供依据。实验方法1、模型制作及分组采用2005年日本文部省召开的国际PTSD科学会议确定的关于大鼠PTSD模型-SPS。其具体方法是将大鼠连续进行下述步骤处理:固定刺激(Immobilization)2h;强迫性游水(Forced swimming)20 min(水深40cm,水温25℃);乙谜麻醉(Ether anesthesia)晕倒后停止麻醉;无干扰空间(Undisturbed)常规喂养。随机分为4组,即对照组及SPS后24h、7d、14d。2、海马MR、GR和下丘脑MR、GR、CRH及AVP的免疫组织化学方法分别选取各组大鼠固定、沉糖的大脑,制作冰冻切片,确定海马、下丘脑的部位后分别用SAβC法进行海马的MR、GR,下丘脑的MR、GR免疫组织化学染色(工作浓度:MR1:300;GR1:800)及下丘脑CRH和AVP染色(工作浓度:CRH1:500;AVP1:1000),DAB显色,中性树胶封片,光学显微镜(OLYMPUS,BX60,Japan)下观察,摄片。3、Western Blotting检测海马、下丘脑MR、GR和CRH分别取新鲜海马和下丘脑组织经匀浆、超声粉碎后高速低温离心,提取上清蛋白,电泳,转膜,经封闭后分别加一抗MR、GR、CRH(MR工作浓度1:500,GR工作浓度1:1000;CRH工作浓度1:800;)4℃过夜;HRP标记IgG(工作浓度1:1500)孵育2h,DAB法显色,扫描各条带计算光密度值。(由于AVP的分子量小,故本文为对其进行Western Blotting检测)4、海马MR和GR免疫荧光双标及共焦激光扫描显微术观察取海马冰冻切片,依次用PBS漂洗,5%BSA封闭20min后,滴加兔抗鼠GR(工作浓度为1:800),4℃孵育过夜,0.1M PBS漂洗,滴加羊抗兔的FITC-IgG,室温2h,经0.1M PBS漂洗后依次滴加正常兔血清IgG室温2h,无标记的Protein A(浓度为1mg/ml)室温2h,兔抗鼠MR抗体(工作浓度为1:300),继续4℃孵育过夜,PBS漂洗后滴加Protein A-Alexa 546,室温2h,0.1mol/L PBS漂洗、封片,激光扫描共聚焦显微镜(CLSM)下观察,摄片。结果一、免疫细胞化学染色结果:1、海马MR免疫细胞化学染色结果:低倍镜下可见MR分布于海马各个区域。分别取海马CA1区于高倍镜下观察可见MR阳性表达产物根据细胞的功能状态而呈现不同部位的表达分布,有的分布于胞核,有的可见表达于胞浆中,并于SPS后24h、7、14天MR的阳性表达亦持续降低。2、海马GR免疫细胞化学染色结果:低倍镜下可见GR的阳性表达产物主要分布于海马的CA1区,高倍镜下可见其主要集中分布于细胞核中,胞浆中相对较少。经SPS后,24h时,可见海马CA1区神经元的阳性表达减弱且突起缩短。7d、14d后,该处神经元的GR的阳性表达逐渐增强,且突起逐渐延伸。3、下丘脑室旁核MR免疫细胞化学染色结果:低倍镜下观察下丘脑室旁核小细胞性神经元和大细胞性神经元中均见MR的阳性表达产物分布。高倍镜下观察MR阳性表达主要集中于神经元的细胞质中。但大鼠经SPS处理后24h、7日、14日与对照组未见明显差异。4、下丘脑室旁核GR免疫细胞化学染色结果:GR的阳性表达产物于低倍镜下主要分布于下丘脑室旁核小细胞性神经元,高倍镜下观察GR阳性表达的神经元主要集中分布于细胞核中,胞质中相对较少。SPS刺激后,24h时,可见下丘脑室旁核内神经元的GR阳性表达减弱,当第7日时,该处神经元的GR的阳性表达增强且高于正常,而第14日时降低回复接近正常对照组。5、下丘脑室旁核CRH免疫细胞化学染色结果:低倍镜下可见下丘脑室旁核中CRH分布于大细胞神经元的胞浆内,当大鼠经SPS处理后,24h、7d时胞浆内CRH呈上升趋势且均高于正常对照组,14d时有所恢复。6、下丘脑室旁核AVP免疫细胞化学染色结果:高倍镜下可见AVP的阳性表达产物主要分布于下丘脑室旁核中神经元的胞体及突起中。经SPS后,AVP的表达变化基本同于CRH,即24h、7d时呈现上升趋势且7d时突起中可见明显的串珠样阳性产物,14d后,该处神经元的AVP的阳性表达逐渐恢复。二、Western blotting检测结果1、海马MR Western blotting检测结果Western blotting检测发现SPS后24h、7d、14d时大鼠海马MR的表达渐续下调。2、海马GR Western blotting检测结果Western blotting检测发现SPS后大鼠海马GR的表达为24h降低、7d、14d时渐续回升。3、下丘脑MR Western blotting检测结果Western blotting检测发现SPS后24h、7d、14d时大鼠下丘脑MR的表达未见明显改变。4、下丘脑GR Western blotting检测结果Western blotting检测显示SPS后24h时GR的表达降低,7d时升高且超过正常,至14d时又降低接近正常。5、下丘脑CRH Western blotting检测结果Western blotting检测发现SPS后大鼠下丘脑内CRH逐渐升高,7d最高,14d时回调。三、海马CA1区MR和GR免疫荧光双标记标本在CLAM下观察,MR-Alexa被543nm波长激发为红色光,GR-FITC被488nm波长激发为绿色光,二者融合为黄色或橙色光。对照组可见MR分布于细胞质和细胞核中,GR主要分布于细胞核中,少数见于细胞质中;SPS-24h时MR主要集中于细胞质中,而细胞核中分布减少,GR未见明显改变;SPS-7d时MR在细胞核中表达进一步减少,GR的主要表达于细胞质中,偶尔见于细胞核内;SPS-14d时MR仍然集中于细胞质内,而GR在细胞质表达减少而细胞核中的表达明显增加。用双重波长激发时,则可见到两种荧光同时出现,显示两光融合而成的黄色或橙色光。对照组该融合光主要集中分布于细胞核,SPS-24h组中细胞核内融合光减弱,当7d时二者融合光主要集中分布于细胞质中,到14d时二者融合光又重新集中于细胞核而细胞质中减少。结论1、海马CA1区盐皮质激素受体(MR)在PTSD中呈现逐步下降趋势,提示PTSD出现的血中糖皮质激素(GC)水平较低与海马MR密切相关。证实了海马对下丘脑的负反馈抑制作用。同时也表明MR与PTSD样大鼠的恐惧相关。2、海马CA1区糖皮质激素受体(GR)在PTSD中呈现出现降低再恢复现象,提示其可能与PTSD的GC水平改变相关。3、海马CA1区MR/GR比值下降提示MR/GR与PTSD海马损伤相关。4、下丘脑MR与PTSD皮质醇激素水平调节的相关性不显著。5、下丘脑GR表达先降低后回调,提示下丘脑内GR水平受海马的影响,进而调控CRH和AVP的变化,影响PTSD皮质醇激素水平的变化。6、下丘脑CRH和AVP同时表现为上调趋势,提示CRH在AVP的协同下调节PTSD皮质醇激素水平,并且与PTSD的神经精神症状的临床表现相关。7、核受体MR、GR在海马CA1区神经元内的表达受PTSD大鼠血浆皮质醇浓度变化影响,并且导致海马受损、功能降低。