论文部分内容阅读
目的:多西他赛（Docetaxel,DTX）是一种半合成的紫杉醇类似物,在临床肿瘤治疗中发挥重要作用。虽然多西他赛具有很高的抗肿瘤活性,但是其水溶性差束缚了多西他赛的临床应用。市售多西他赛注射液使用吐温80和乙醇作为增溶剂,会引起过敏和体液潴留等严重不良反应。多西他赛注射液使用前还要预先服用糖皮质激素防止过敏,并且禁止使用PVC材质的静脉输液装置,给临床应用带来不便。因此,将多西他赛进行衍生做成前药,进而开发一种低毒、高效的新剂型意义重大。白蛋白纳米制剂的制备利用了NabTM技术,当其通过静脉注射进入血液后崩解成为白蛋白-药物复合物,其大小和血液中的内源性白蛋白相似,可以像天然白蛋白一样通过血管内皮细胞的gp60通道和小窝蛋白介导的跨膜作用向肿瘤部位和细胞内聚集,再通过肿瘤细胞过度表达的富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白（Secreted protein,acidic and rich in cysteine,SPARC）将药物靶向到肿瘤细胞。因此,本研究旨在合成多西他赛脂肪酸衍生物并将其制备成白蛋白结合型的纳米粒,在制备成多西他赛前药同时还避免使用表面活性剂,使其具备了减毒、靶向的特性,为后续研究提供了新的思路和实验依据。方法:通过酯化反应在多西他赛2’-羟基位点上合成2、4、6、8、10不同碳链长度的多西他赛脂肪酸衍生物。以人血白蛋白（Human serum albumin,HSA）为材料,以多西他赛脂肪酸衍生物为主药,利用Nab TM技术制备多西他赛脂肪酸衍生物白蛋白纳米粒。以粒径的多分散系数（Polydispersity index,PDI）、包封率（Encapsulation efficiency,EE%）、过滤回收率为评价指标,对HSA质量浓度、油相药物浓度、蒸发加热温度进行考察,利用三因素五水平的星点设计-响应面法对处方和工艺进行筛选。对采用最优处方和工艺制备的白蛋白纳米粒进行质量研究,主要包括粒径分布、Zeta电位、包封率、载药量和含量等指标的测定。考察了复溶后的白蛋白纳米粒溶液24 h内的稳定性以及冻干品6个月的质量稳定性。对制备得到的一系列多西他赛脂肪酸白蛋白纳米粒进行动物体内毒性试验研究,确定各白蛋白纳米粒的最大耐受剂量（MTD）,在同等毒性剂量下考察不同脂肪酸衍生物纳米粒裸鼠的胃肠道组织和血液毒性。利用MTT法对多西他赛丁酰酯（C4-DTX）和DTX进行了体外药效对比考察。C4-DTX在BEL-7402、HT-29和SK-OV-3三种细胞系内向DTX转化研究。对多种不同肿瘤细胞中羧酸酯酶和SPARC蛋白的mRNA相对表达量进行测定。并依据多西他赛的临床适应症选择SGC-7901（人胃癌细胞）建立异种移植肿瘤模型,对多西他赛脂肪酸衍生物白蛋白纳米粒的药效和体内组织分布进行考察。结果:MS、FT-IR和1H-NMR等结果证实采用现有合成方法可以成功合成得到一系列多西他赛脂肪酸衍生物。以C4-DTX为模型药物,采用星点设计-效应面法（CCD-RSM）对处方和工艺进行筛选和优化得到的最优参数:HSA质量浓度为0.05 g/mL;油相药物浓度为151.19 mg/mL;蒸发加热温度为46℃。采用该处方和工艺制备得到的纳米粒:粒径为（74.43±2.09）nm;PDI为（0.143±0.944）;药物结合率为（96.50±0.87）%;过滤回收率为（97.42±2.09）%;载药量为（22.43±2.05）%;电位为-（30.5±2.05）mV。复溶后的C4-DTX-NP溶液室温8 h内和冷藏或冷冻24 h内纳米粒的粒度及其分布、药物含量和包封率无显著变化;其冻干品在2030℃内储存6个月各项指标亦均无明显变化。通过毒性试验确定C4-DTX-NP、C6-DTX-NP、C8-DTX-NP、C10-DTX-NP和DTX-inj组的MTD值分别为80、65、30、30、30μmol/Kg。在同等毒性剂量下测得衍生物纳米粒对裸鼠饮食无显著影响。与DTX-inj组相比,C6-DTX-NP对血液毒性最小（P<0.05）,C4-DTX-NP次之（P<0.05）,C8-DTX-NP和C10-DTX-NP与DTX-inj组无显著差异（P>0.05）。体外药效学试验结果显示,C4-DTX对HT-29、SGC-7901、MCF-7、CFPAC、SPC-A-1、BEL-7402细胞有抑制作用。体内药效学试验中,在同等毒性剂量下,C4-DTX-NP组对肿瘤增长抑制作用优于DTX-inj组（P<0.05）,C6-DTX-NP优于DTX-inj（P<0.01）和C10-DTX-NP（P<0.05）组,C8-DTX-NP、C10-DTX-NP和DTX-inj之间无显著差异（P>0.05）。在组织分布试验中,C4-DTX-NP给药24 h后可以看到DTX在肿瘤组织的浓度明显高于其他部位。结论:本研究成功合成得到了一系列多西他赛脂肪酸衍生物;以C4-DTX为模型,利用Nab TM技术成功制备制备白蛋白纳米粒,并进行了处方筛选和工艺优化,制备的C4-DTX-NP具有粒径分布良好、包封率高、载药量大、物理性质稳定等优势;制备的一系列白蛋白纳米粒,C4-DTX-NP和C6-DTX-NP毒性明显低于DTX-inj;在体内药效学中其药效要明显优于DTX-inj;C4-DTX-NP给药后,组织分布试验表明其具有肿瘤靶向性。