尽管心脏手术和药物治疗取得了显著进步,心肌梗死(myocardial infarction,MI)等心血管疾病仍然是导致全球人类死亡的主要原因之一。MI可造成大量心肌细胞(cardiomyocytes,CMs)不可逆转性损失,然而成体心肌细胞几乎没有再生能力,所以心肌修复受限于可替代性的CMs来源。多能性干细胞(pluripotent stem cells,PSCs)包括胚胎干细胞(embryonic stem cells,ESCs)和诱导性多能干细胞(induced pluripotent stem cells,i PSCs)具有自我更新和向三胚层细胞(包括CMs)分化的能力可为治疗心肌梗死等心脏疾病、药物发现和心脏毒性筛选等提供细胞来源。然而相对于ESCs,人i PSCs(hiPSCs)可来源于成体各个组织,细胞来源方便和广泛,还避免了伦理问题,因此hiPSCs源性心肌细胞(hiPSC-CMs)将有助于为心肌梗死等心血管疾病治疗提供潜在的细胞来源。但目前研究认为,hPSCs-CMs类似于胎儿或胚胎期CMs,在结构和功能上具有不成熟性,可能导致心律不齐、代谢紊乱等问题,严重制约其临床应用的可能性。目前应用于促进幼稚型CMs(干细胞源性CMs和新生CMs等)成熟的方法有:长时间体外培养、添加化学因子、施加机械拉力和电刺激等,但收效甚微。众所周知,在心脏发育和成熟过程中不仅受到生理因素、旁分泌激素的影响,还受到机械因素的作用。心组织的弹性模量从胚胎到新生再到成体的过程中逐渐增加,以适应心脏正常生理功能,然而在梗死区的进一步增加,反而产生不良效果。但目前尚未见基质硬度对hiPSCs-CMs成熟性的全面报道。有报道称,模拟正常心肌硬度可促进大鼠新生CMs的收缩功能的成熟,这提示模拟正常心肌硬度可能会促进hiPSCs-CMs成熟。在考虑促成熟策略之前,我们以成熟(成体)和未成熟(胎儿)CMs特征的差异性作为评判hiPSC-CMs成熟状态的基准。成熟性CMs结构和功能特征主要体现在(1)有序的肌节,肌节是CMs形态和收缩的结构和功能单位;(2)强健的钙瞬变,钙瞬变是兴奋-收缩偶联的功能基础,广泛用于衡量CMs的功能;(3)增殖性低;(4)基因表达谱,成体结构基因表达增多;(5)成熟的能量供应站—线粒体,其结构和功能的改变是心脏成熟的关键部分。基于以上考虑,本研究拟以“基质硬度是影响干细胞源性心肌细胞成熟的重要因素”为立足点,通过基质硬度对hiPSC-CMs的肌节、基因和蛋白表达、钙瞬变、增殖性和线粒体结构和功能的影响及机制的研究,评估基质硬度对hiPSC-CMs成熟度的影响,探讨获得成熟度较高hiPSC-CMs的方法,为干细胞移植治疗心肌疾患的临床应用提供实验依据,以推动干细胞治疗的临床应用。第一部分化学成分既定方法诱导hiPSC-CMs的成熟性目的:通过化学成分既定的方法诱导hiPSCs为CMs,评估常规诱导CMs的成熟性。方法:使用mTeSR培养基复苏培养hiPSCs细胞系(>20代),每天换液。使用Versene无酶消化液分离传代hiPSCs,通过免疫荧光染色和流式细胞仪检测hiPSCs的多能性。采用化学成分既定的方法即添加Wnt信号通路激活剂CHIR99021和抑制剂IWR-1,在RPMI1640和B27培养基下诱导hiPSCs为CMs,利用倒置相差显微镜观察细胞搏动,通过免疫荧光染色和流式细胞仪检测CMs标志性分子表达,通过透射电子显微镜(transmission electron microscope,EM)观察CMs亚纤维结构,并通过Edu染色检测CMs的增值性。结果:hiPSCs呈集落性生长,长势极快。免疫荧光学染色检测干细胞多能性标志分子SSEA-4和OCT3/4表达阳性,流式细胞仪检测SSEA-4表达量为99.3%,OCT3/4表达量为98.0%。诱导8-10天可观察到CMs的区域性搏动,第12天左右以同一频率搏动。免疫荧光染色可见CMs结构性标志分子心肌肌钙蛋白(cardiac troponin T,cTnT)和肌动蛋白(α-Actinin(Sarcomeric),a-Actinin)表达阳性,但细胞形态多样,肌节排列不规则。流式细胞仪检测cTnT阳性表达率可达90%以上,而不成熟CMs标志分子平滑肌肌动蛋白(α-Smooth Muscle Actin,a-SMA)表达为99.2%。EM显示肌节呈片段状存在并由片段化的Z线连接,不存在横线管等结构。Edu染色显示部分CMs呈阳性表达。结论:通过化学成分既定的方法可诱导hiPSCs为CMs,效率可达90%左右,但CMs具有不成熟性。第二部分基质硬度对hiPSC-CMs成熟性的影响目的:在体外模拟正常和梗死心肌硬度条件下,通过检测基质硬度对hiPSC-CMs肌原纤维分布、肌节结构、心肌结构蛋白和基因的表达、钙瞬变和细胞增殖性的作用,评估基质硬度对hiPSC-CMs成熟性的影响。方法:将聚二甲基硅氧烷(polydimethylsiloxane,PDMS)基底胶与固化剂以30:1和60:1的比例混合,分别制成硬(Stiff PDMS)和软(Soft PDMS)基质分别模拟心肌梗死和正常心肌硬度,并使用聚乙烯亚/聚(4-苯乙烯磺酸)(PEI/PSS)进行亲水化表面处理。通过倍增时间和细胞粘附率检测hiPSCs在PDMS上的粘附和增殖性。将hiPSCs接种在Stiff PDMS和Soft PDMS上,组织培养皿(TCPs)作为对照。通过化学既定的方法诱导hiPSCs为CMs。30天后,通过倒置相差显微镜观察不同基质硬度下CMs自发搏动率。通过免疫荧光染色和透射电子显微镜观察hiPSC-CMs肌原纤维排列和肌节结构;通过流式细胞仪、蛋白免疫印迹(WB)和Human Transcriptome Array 2.0(HTA2.0)检测心肌结构蛋白和基因的表达以及全基因表达谱。通过Fura-2检测hiPSC-CMs钙瞬变,并通过WB和HTA2.0检测钙相关蛋白和基因的表达变化。通过Ed U标记染色和ki67流式细胞仪检测hiPSC-CMs细胞周期活动。结果:hiPSCs在Soft PDMS和Stiff PDMS的贴壁率均可达99%以上,没有显著性差异。在TCPs、Soft PDMS和Stiff PDMS中hiPSCs增殖的倍增时间没有显著性差异,分别为:19.28±0.48h,19.67±1.05h和18.56±0.72h。hiPSC-CMs在TCPs和Stiff PDMS的平均搏动速率约为35次/min,而在Soft PDMS的搏动次数多为60次/min。α-Actinin和cTnT的免疫荧光染色和透射电子显微镜显示在Soft PDMS上肌原纤维排列更加有序,肌节长度没有明显改变,但Z线长度从TCPs上的0.28±0.09μm增长到Soft PDMS上的0.56±0.15μm。流式细胞仪结果显示cTnT阳性率在TCPs、Stiff PDMS和Soft PDMS上分别为89.49±3.13%,89.56±3.24%和96.13±1.40%,并且Soft PDMS上cTnT和α-Actinin共表达率升高,在TCPs、Stiff PDMS和Soft PDMS上分别为73.70±2.11%,80.40±3.62%和92.40±2.43%。流式细胞仪和WB结果均显示在Soft PDMS上心脏结构基因表达增加,HTA2.0结果显示结构基因表达虽有所增高,但并没有显著性差异;而原始心肌标志分子a-SMA表达却显著性降低。HTA2.0检测全基因表达谱没有显著性改变。hiPSC-CMs呈现稳健的、低缓的钙瞬变曲线,曲线上升和下降均以较慢的速率进行。Soft PDMS中钙瞬变上升(dep v)和下降(ret v)曲线速率明显升高,幅度(peak h)也增加,相对应的曲线下降所需要的时间sin exp tau减小;钙瞬变相关蛋白和基因表达均升高。EdU标记hiPSC-CMs处于分裂期的细胞比例分别为:21.82±1.46%,12.75±1.68%和7.97±2.89%;ki67流式细胞仪检测处于细胞周期的细胞比例分别为27.08±2.45%,26.13±1.76%和17.61±1.42%。结论:基质硬度对hiPSCs的增殖性和贴壁率没有影响。Soft PDMS促使心肌细胞搏动频率趋于正常CMs搏动频率,Soft PDMS促细胞形态结构的成熟性:肌原纤维排列有序,肌节长度虽不变但Z线增长,结构蛋白表达增加。Soft PDMS促进hiPSC-CMs的功能性成熟:钙瞬变增强,钙相关蛋白增加,增值性减弱。第三部分基质硬度hiPSC-CMs线粒体的影响目的:线粒体和功能的改变是CMs成熟的关键部分。通过基质硬度对hiPSC-CMs线粒体结构和功能影响的研究,探讨基质硬度与线粒体成熟性的关系。方法:使用线粒体绿色荧光探针(MTG)标记活细胞线粒体形态,通过线粒体标志性分子Tom20结合肌原纤维标记物α-Actinin进行免疫荧光染色,显示线粒体在hiPSC-CMs的结构关系。透射电子显微镜观察线粒体在基质硬度对线粒体结构的影响,WB和HTA2.0检测线粒体结构蛋白和基因的表达。通过TMRE和MTG检测基质硬度下线粒体膜电位。ATP lite Luminescence Assay System(ATP lite)检测基质硬度下hiPSC-CMs的细胞内ATP产量,并通过WB和HTA2.0检测氧化磷酸化复合体蛋白和基因的表达,采用seahorse system检测线粒体耗氧补偿率OCR。CM-H2DCFDA与线粒体远红荧光探针MTDR检测线粒体超氧化物水平。Rhod-2和MTG检测线粒体钙表达水平。溶酶体远红荧光探针LTDR和MTG检测溶酶体表达量。细胞色素C和Tom20共定位免疫荧光染色检测线粒体凋亡作用。结果:MTG标记发现在Soft PDMS上线粒体呈更延长和交互的网状结构,而在对照组中线粒体更多地呈现短棒状等形态。Tom20和a-Actinin的免疫荧光染色显示基质越硬线粒体越倾向于围绕在细胞核周围,与不规则或圈形排列的肌原纤维具有较少的关联,而在Soft PDMS上,线粒体以线性的形态向细胞纵轴延伸,并且分布在肌原纤维之间。透射电子显微镜显示Soft PDMS上线粒体具有层状嵴,线粒体长度和面积,以及线粒体嵴的长度均具有显著性增长。相对于其他两组,在Soft PDMS中ATP lite检测到细胞内ATP产量稍高,WB和HTA2.0检测相应的氧化连酸化复合物的蛋白和基因水平表达升高;线粒体膜电位势能显著性增强;并且提高了线粒体耗氧补偿率,增加基础呼吸和最大呼吸量。Soft PDMS可降低线粒体活性氧和钙的积累,以及减少溶酶体表达量。免疫荧光染色并未发现细胞色素C从线粒体中释放,并且HTA2.0显示在Soft PDMS上细胞凋亡受到抑制。结论:Soft PDMS促进hiPSC-CMs线粒体的成熟:线粒体形态延长,层状嵴结构,线粒体膜电位升高,氧化磷酸化能力提高,耗氧补偿率增加和有害物质清除力增强。第四部分Soft PDMS促进hiPSC-CMs成熟的机制目的:通过检测机械转导子YAP/TAZ,在基质硬度上hiPSC-CMs中的表达变化,探讨基质硬度通过YAP/TAZ调节hiPSC-CMs成熟的可能性;通过激活/抑制Wnt信号通路,检测YAP/TAZ和线粒体形态功能的变化,进一步探讨在hiPSC-CMs诱导分化过程中涉及的Wnt信号通路和基质硬度下YAP/TAZ以及线粒体动态间的作用关系,阐明Soft PDMS促进hiPSC-CMs成熟的机制。方法:通过WB检测各组线粒体融合标志性分子Mfn2和Opa1,分裂标志分子Drp1以及YAP、TAZ和磷酸化YAP的表达。免疫荧光染色检测YAP在细胞内定位。通过HTA2.0检测Wnt信号通路,Hippo信号通路和差异性基因的表达。在Soft PDMS和TCPs中分别添加Wnt信号通路的抑制剂IWR-1和激活剂CHIR99021,通过MTG标记检测线粒体形态,通过TMRE标记检测线粒体膜电势,WB检测YAP/TAZ和Mfn2和Drp1的表达变化。结果:在Soft PDMS中,WB发现Mfn2和Opa1表达升高,Drp1降低。YAP免疫荧光染色发现各基质硬度下均细胞核定位,HTA2.0检测可见在Soft PDMS上YAP基因表达稍低,而TAZ稍高,但均没有显著性差异;WB检测YAP蛋白表达稍低,但TAZ蛋白显著性升高。在TCPs中添加CHIR后,线粒体形态延长,线粒体膜电势相对增高,Mfn2表达升高,Drp1和YAP/TAZ表达降低;在Soft PDMS中添加IWR-1后,线粒体形态缩短,线粒体膜电势相对降低,Mfn2表达降低,Drp1和YAP/TAZ表达上调,但以上表达变化均没有统计学意义。结论:基质硬度上调节Wnt信号通路诱导hiPSCs向hiPSC-CMs分化成熟过程中,存在Wnt信号通路、线粒体动态和YAP/TAZ交互关系网络:抑制Wnt信号通路,降低线粒体融合和增加YAP/TAZ表达。总之,Wnt信号通路,线粒体动态和YAP/TAZ之间的交互作用促使Soft PDMS上的hiPSC-CMs更有序的肌节排列,增强钙瞬变,降低增殖性,延长线粒体形态,改善线粒体结构,增强线粒体功能,从而促进hiPSC-CMs的成熟性。