EB病毒（Epstein-Barr Vrius,EBV）作为疱疹病毒科成员,是第一个被发现的与人类肿瘤有关的病毒。现已明确EB病毒与鼻咽癌（NPC）、Burkitt淋巴瘤（BL）、何杰金氏（HD）、非何杰金氏淋巴瘤、免疫抑制后淋巴瘤、外周T细胞淋巴瘤有关。在其他肿瘤如胃癌、肺癌等肿瘤组织中发现也有EB病毒DNA的存在。NPC在东南亚尤其是中国南部发病率非常高,达到了10-50/100,000/年,是我国重点防治的十大肿瘤之一。目前放射治疗是鼻咽癌治疗的基本方法,鼻咽癌治疗后总的5年生存率为50～60%。局部复发和远处转移是鼻咽癌治疗失败主要原因。细胞免疫在清除病毒感染和肿瘤免疫监视过程中起着十分重要的作用。我国早在80年代初期,就研究了鼻咽癌外周血淋巴细胞CTL介导的细胞免疫反应及其HLA的限制现象。发现鼻咽癌患者的T淋巴细胞对鼻咽癌细胞有一定的特异性杀伤作用。因此,提高针对肿瘤细胞的特异性CTL应答水平,可以抑制肿瘤的复发和转移。在恶性肿瘤细胞中表达的病毒性抗原是具有显著意义的免疫抗原。NPC中EB病毒的存在提供了一个基因治疗的靶位。在NPC表达的EBV蛋白仅有EBNA1,LMP1（部分NPC病例）,LMP2。其中,EBNA1包含一个Gly-Ala重复序列,会阻断它对HLAⅠ类限制性T细胞的处理和呈递。LMP1有致癌性,在不同地区病毒分离株中存在很大变异。LMP2是在NPC等EB病毒相关肿瘤组织中持续表达的病毒蛋白之一,且存在于细胞的表面,LMP2基因不引起B淋巴细胞的转化、无致癌性,是一个很好的可以引发CTL反应的蛋白,已经鉴定出了多种受HLAⅠ限制的CTL表位,而且其序列保守,与之相关的HLA型别如A2在中国人群中较常见。因此,LMP2成为免疫治疗NPC的良好靶抗原。腺病毒具有宿主范围广泛,可感染分裂期细胞,也可感染静止或终末分化细胞;能诱发较强的细胞免疫以及应用方便等优点,被广泛应用于肿瘤免疫治疗研究中。目前最常用腺病毒载体为Ad5型腺病毒,它感染需要CAR受体存在于受感染的细胞表面,且转染效率与细胞表面CAR密度密切相关。而在许多重要细胞上CAR表达通常是低水平或几乎不表达,包括许多肿瘤细胞、骨骼肌细胞、淋巴细胞、纤维细胞、巨噬细胞、单核细胞源性树突状细胞及造血干细胞等,缺乏CAR表达的细胞除非用高滴度的病毒感染,否则效率不高。用Ad35纤维修饰Ad5型病毒构建的Ad3F35型腺病毒可与普遍存在于细胞（如DC细胞）表面的受体膜蛋白CD46结合,不依靠CAR受体存在而感染相应靶细胞。研究发现用Ad5F35感染DC等细胞明显比用Ad5或Ad5经过其它B组腺病毒纤维修饰的腺病毒更有效。本研究的目的是在初步了解鼻咽癌患者EB病毒相关细胞免疫情况下,构建Ad5F35-LMP2非复制型重组腺病毒,并检测其免疫效果。首先我们采用荧光定量PCR方法检测NPC患者、EBV-VCA-IgA阳性和正常人对照组三组人群血清EBV-DNA,免疫酶法检测EBV-VCA-IgA抗体,ELISPOT方法检测外周血中EBV-LMP2特异性CTL反应,流式细胞术检测外周血T细胞亚群、CD4⁺CD25⁺细胞比率,结果显示在NPC患者血清中的EBV-DNA与另二组人群血清中EBV-DNA无论在阳性率还是在定量上都具有显著性差异,且EBV-DNA水平在NPC患者中进展期明显高于病程早期;血清中EBV-VCA-IgA的效价在NPC组和EBV-VCA-IgA阳性人群之间差异也有统计学意义;EBV-LMP2特异性CTL反应在健康对照组呈现较高的反应,EBV-VCA-IgA阳性人群次之,NPC病人最低,且EBV-LMP2特异性细胞免疫反应阳性率与血清中EBV-DNA载量相关;晚期鼻咽癌患者外周血CD³⁺、CD⁴⁺细胞亚群数量低于正常人,CD4⁺CD25⁺细胞比率高于正常人;74%NPC病人LMP2抗体阳性,EBV-VCA-IgA阳性人群和健康对照组均未检测到LMP2抗体。接着,我们以EBV-LMP2为靶基因,构建了Ad5F35-LMP2的复制缺陷型重组腺病毒疫苗作为NPC等EB病毒相关肿瘤的免疫疫苗。我们将EB病毒LMP2基因插入穿梭质粒PDC316中,使用Admax系统通过脂质体将穿梭质粒PDC316和腺病毒骨架质粒导入293细胞中使病毒得到包装。经体外感染293细胞,将病毒上清进行PCR鉴定,结果证实病毒DNA中含有目的基因的特异性片段。RT-PCR证明了外源基因在真核细胞中得以转录,免疫酶的结果也显示LMP2蛋白在真核细胞得到有效表达。为初步探讨其免疫效果,将Ad5F35-LMP2重组腺病毒肌肉注射灵长类动物恒河猴,分高(1.5×10¹⁰TCID50/只)、中（1.5×10⁹TCID50/只）、低（1.5×10⁸TCID50/只）和PBS对照4组进行免疫,每组4只。每1个月加强免疫1次,共免疫3次,分别于免疫前（0周）和免疫后第4、8、12周采集猴外周血。分离猴子外周血淋巴细胞及血清,ELISPOT方法检测抗LMP2的特异性细胞免疫应答和免疫酶法检测LMP2的特异性抗体。结果发现3个剂量组的猴子都可以产生针对LMP2的特异性细胞及体液免疫应答,且随着免疫病毒次数和剂量增多,产生细胞免疫应答的猴子数量增多,反应增强,高剂量组免疫后产生的免疫应答比低剂量组高,诱导的免疫应答的高低与免疫剂量之间存在一定的依赖关系,其中,给予高病毒剂量免疫的恒河猴,1×10⁶个外周血单个核细胞中,经LMP2多肽刺激后释放细胞因子IFN-γ的细胞数最高可达650个。EBV-LMP2特异性抗体在疫苗初次免疫4周时开始产生,第8～12周时抗体的滴度较高。用PBS作为对照组的恒河猴则没有引起相应的免疫反应。为了解重组腺病毒体外感染的DC是否能够活化特异性的CTL,我们首先进行了体外试验。在体外试验中,我们选择的志愿者是与CNE-2细胞有着相同的HLA-A11型别的正常人,分离外周血单个核细胞,经培养并用LMP2重组腺病毒感染树突状细胞（DC）后活化自身的T细胞,然后按一定比例将CTL细胞加入到前一天接种的CNE-2细胞,继续培养48小时后采用MTT法检测CNE-2细胞的增殖,结果显示LMP2重组腺病毒修饰的DC与无关基因重组腺病毒修饰的DC相比,其体外活化的CTL可以在体外有效抑制CNE-2肿瘤细胞的生长,效靶比为20:1时,其抑制率分别是46.59%和28.30%;接着我们还进行了体内抑制肿瘤生长的试验。SCID小鼠经人外周血单个核细胞悬液注射后,再分别用Ad5F35-LMP2-DC及未转染DC腹腔注射免疫,末次免疫7天后用1×10⁶的CNE-2肿瘤细胞接种于小鼠皮下,观察小鼠体内肿瘤生长情况,第4周处死小鼠,取肿瘤称重并作病理学检查,结果显示Ad5F35-LMP2-DC组肿瘤的潜伏期明显延长,CNE-2阳性对照组和未修饰DC组小鼠1周左右就出现了肿瘤,而Ad5F35-LMP2-DC组则直到2周后才出现肿瘤;且肿瘤体积较小,重量较轻,平均肿瘤抑制率为89.18%。总之,鼻咽癌患者细胞免疫功能降低,血清EBV-DNA升高。我们构建的Ad5F35-LMP2重组腺病毒可以在动物体内成功诱导LMP2特异性细胞和体液反应;Ad5F35-LMP2重组腺病毒修饰的DC疫苗可以在体内以及体外活化LMP2特异性的CTL,而且这种活化的CTL还可以杀伤NPC肿瘤细胞。因此有可能成为针对EBV相关肿瘤包括NPC病人的治疗性疫苗。