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研究背景和目的同种异体复合组织移植对特殊部位或大面积组织缺损的修复效果较理想,但为避免术后急性排斥反应,患者需长期大剂量服用免疫抑制剂,产生诸多副作用,阻碍其临床开展。间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)以其免疫调节作用成为同种异体复合组织移植免疫领域的研究热点。MSCs通过旁分泌细胞因子和细胞直接接触作用调节多种免疫细胞的活化和增殖,并有研究指出脂肪来源的MSCs免疫调节作用优于其他组织来源的MSCs。同种异体复合组织移植急性排斥反应由T淋巴细胞介导,次级淋巴器官(secondary lymphoid organs, SLOs),包括脾和淋巴结等,是T细胞定居和启动免疫反应的场所。然而,静脉注射的MSCs在体内各组织器官中随机分布,体内对T细胞的免疫调节作用不如体外理想。研究表明,利用含CCR7基因的慢病毒转染可使MSCs过表达CC趋化因子受体-7 (CC chemokinereceptor7,CCR7)并有效归巢于次级淋巴器官,有助于减轻T细胞介导的移植物抗宿主反应。因此,本课题旨在探索人脂肪间充质干细胞(human adipose-drived stem cells, hASCs)是否能过表达大鼠的CCR7并能有效归巢大鼠的次级淋巴器官,从而减轻大鼠同种异体复合组织移植后的急性排斥反应,为临床治疗同种异体复合组织移植早期的免疫排斥反应提供新的策略。方法1.细胞准备。1)分离培养鉴定hASCs,RT-PCR和流式方法检测炎性细胞因子刺激前后的hASCsCCR7水平;2)用含有大鼠CCR7-GFP基因及其对照GFP基因的慢病毒转染 hASCs,使其成为 rCCR7-GFP-hASCs(C-A)和 GFP-hASCs(G-A),RT-PCR方法检测转染后细胞内基因元件WPRE水平及CCR7水平,流式方法检测膜CCR7表达水平;3)比较病毒转染前后细胞的表面标志物(流式检测),分化能力(诱导成骨、成脂、成软骨分化)及细胞增殖能力(CCK-8法)。2.体外趋化能力和体内归巢能力检验。1)利用transwell检测C-A和G-A向趋化因子CCL21的定向迁移能力;2)流式方法检测比较静脉注射C-A和G-A的大鼠脾和淋巴结中GFP阳性细胞所占比例;3)脾和淋巴结的冰冻切片免疫荧光染色检测细胞是否归巢次级淋巴器官及其与T细胞的空间分布关系。3.体内外C-A对大鼠T细胞的免疫调节作用的检测。1)体外,将hASCs、C-A和G-A各以两个浓度梯度与混合淋巴反应共培养,流式检测T细胞分化情况(CD4+的辅助性T细胞所占比例及其中Th1、Th2、Th17、Treg所占比例)以及上清中的细胞因子IFN-γ、IL-2、IL-6、IL-17、IL-4、IL-10的含量;2)大鼠尾静脉注射细胞24h后,行同种异体下腹部皮瓣游离移植,术后连续观察皮瓣外观变化,比较术后第3d、7d、14d皮瓣病理表现,检测脾和淋巴结中T细胞分化情况及血浆中细胞因子IFN-γ、IL-2、IL-6、IL-17、IL-4、IL-10的含量(方法同上)。结果1、hASCs成功分离,且炎性细胞因子刺激前后均检测不到CCR7表达;含CCR7-GFP基因的慢病毒及其对照GFP病毒转染均使hASCs表达绿色荧光蛋白;C-A和G-A胞内WPRE水平明显高于未转染的hASCs细胞(P<0.001),且C-A高表达大鼠CCR7, G-A不表达CCR7;转染前后的细胞形态、表面标志物、分化能力和增殖能力无明显差异。2、体外,C-A向趋化因子迁移量较G-A显著增多(P<0.001);大鼠体内,C-A注射组脾和淋巴结中GFP阳性细胞所占比例显著高于G-A注射组(P<0.01);脾和淋巴结冰冻切片免疫荧光染色中,C-A或G-A自发绿色荧光,T细胞被标记红色荧光,C-A注射组脾和淋巴结中绿色荧光细胞明显多于G-A注射组,且绿色荧光细胞聚集于发红色荧光的细胞周围。3、①体外混合淋巴反应结果:hASCs组细胞增殖的集落少于对照组,CD4+细胞比例及Th1/ Th2比值显著低于对照组(P<0.01),Treg/Th17比值高于对照组(P<0.05);hASCs组上清中促炎细胞因子IFN-y、IL-2、IL-6、IL-17含量低于对照组(P<0.05),而抗炎细胞因子IL-4、IL-10高于对照组(P<0.05);不同浓度hASCs比较,差别有统计学意义。②皮瓣观测结果:C-A组移植物存活时间较G-A组和单纯移植组长(P<0.01);外观出现急性排斥反应的最初征象较其余两组晚;同一取材时间点,C-A组的病理表现最轻。③体内指标检测结果:C-A组脾和淋巴结中Th1/Th2比值高峰出现较晚,之后迅速下降,Treg/Th17比值持续升高;当其余两组血浆IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10较高时,C-A组相应指标较低。之后C-A组IFN-γ、IL-2先升高又迅速降低,IL-4、IL-10持续升高,IL-6、IL-17缓慢上升又下降。结论CCR7-hASCs能有效归巢次级淋巴器官并聚集于T细胞分布区,通过调节Th1/Th2和Treg/Th17平衡,减轻大鼠异体复合组织移植早期的急性排斥反应,为应用hASCs调节同种异体复合组织移植的免疫反应提供一定的依据。