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实验目的： 提取小鼠骨髓间充质干细胞体外培养并应用IL-4和GM-CSF诱导分化成树突状细胞(Dendritic cells，DCs)。在LPS所介导的DCs活化过程中，利用RNA干扰的方法抑制体外培养的小鼠骨髓来源DCs白介素1受体相关激酶1(IL-1receptor-associated kinase-1，IRAK-1)的表达，研究DCs表面协同刺激分子表达、Toll样受体信号传导通路的信号传导以及炎症因子释放情况，探讨IRAK-1在DCs分化成熟过程中的关键作用。并进一步将小鼠骨髓来源DCs与同源幼稚T细胞共培养，研究IRAK-1基因表达抑制后对DCs促T细胞增殖生物功能的影响。利用髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(myelin oligodendrocyte glycoprotein，MOG)致敏小鼠制作实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)模型，免疫组织化学方法查看IRKA-1在EAE模型中的表达情况，探讨其在神经系统免疫性疾病发生发展过程中的作用机制。 实验方法： 1、IRAK-1在LPS介导的骨髓来源树突状细胞(bone marrow derived dendritic cells，BMDCs)成熟分化过程中作用机制的研究 小剂量GM-CSF和IL-4联合体外诱导培养4-6周C57BL/6小鼠骨髓来源的DCs，第6天收获得到一定数量的DCs，经CD11c免疫磁珠分选，获得纯化的树突状细胞。流式细胞仪分析表明，CD11c（树突状细胞的特异性标记）阳性细胞纯度达95％以上。利用RNA干扰技术沉默DCs内IRAK-1基因的表达，继之给予LPS刺激DCs分化成熟，应用流式细胞学技术检测DCs表面分子CD86、MHC-Ⅱ、CD40表达情况，应用RT-PCR方法检测DCs内信号传导通路TLR4、IRAK-4、IRAK-1及NF-κB mRNA的表达，应用酶联免疫吸附(Enzyme linked immunosorbent assay，Elisa)方法检测DCs炎性因子IL-10、IL-12和TNF-α生成情况;提取同种小鼠脾源性幼稚T淋巴细胞与DCs进行混合细胞培养，利用MTS检测IRAK-1基因沉默后DCs对T细胞增殖的影响。 2、IRAK-1在小鼠EAE模型中的表达 将MOG用PBS稀释成2mg/ml溶液，然后与完全福氏佐剂（不完全福氏佐剂混合结核杆菌素）充分混合，作为致敏原致敏C57BL/6小鼠制作EAE模型，取模型组及对照组小鼠脑及脊髓组织浸入4％多聚甲醛固定。石蜡包埋后切片，取大脑中部、脑干和颈髓进行IRAK-1免疫组织化学染色。利用Leica光镜显微镜观察IRAK-1在小鼠EAE模型中的表达情况，探讨其在EAE发生过程中作用。 实验结果： 1、在给予LPS刺激BMDCs分化成熟过程中，利用RNA干扰方法降低BMDCs内IRAK-1基因表达后，流式细胞仪检测发现可显著降低BMDCs表面协同刺激分子CD86、MHC-Ⅱ、CD40的表达，Real-time PCR方法检测可见细胞内IRAK-1、NF-κB p65的mRNA表达下降，而TLR4、IRAK-4的mRNA表达无明显变化;进一步行ELISA实验显示促炎性细胞因子IL-12和TNF-α的释放减少，而抑炎性因子IL-10的释放增加;混合细胞培养显示IRAK-1基因抑制后，经LPS刺激活化的BMDCs促T细胞增殖能力明显下降。 2、应用MOG致敏制作EAE小鼠模型，行免疫组化显示IRAK-1在小鼠的大脑、脑干及脊髓均有表达，胞浆内及细胞核内均可见IRAK-1表达，尤以胞浆内表达更为显著，且将EAE模型组与非EAE模型组小鼠的IRAK-1表达相比较，EAE模型组小鼠大脑、脑干及脊髓内IRAK-1蛋白的表达均明显高于非EAE模型组，提示IRAK-1在EAE的生成过程中发挥着重要的作用。 实验结论： 1、在LPS介导的DCs分化成熟过程中IRAK-1发挥着重要的中继作用，IRAK-1基因表达下降可抑制DCs的分化与成熟，下调其表面协同刺激分子表达、阻断细胞内炎性信号通路传导、抑制促炎症因子释放、促进抑炎性因子释放。 2、IRAK-1基因表达下降可减弱DCs促T细胞增殖的能力。 3、EAE小鼠神经系统内IRAK-1表达增高。