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哺乳动物非受体酪氨酸激酶c-Abl是Abelson小鼠白血病病毒原癌基因v-abl在细胞内的同源基因。c-Abl能通过其激酶活性参与调控细胞周期、细胞凋亡、细胞黏附、细胞迁移、骨架重塑、DNA损伤应激等过程。Plk1是一类广泛存在于真核细胞中的丝氨酸/苏氨酸激酶。Plk1可通过其激酶活性与多种底物相互作用,调节细胞有丝分裂、胞质分裂、DNA损伤应答、肿瘤发生等过程。c-Abl及Plk1均在细胞信号转导途径中发挥重要的作用,两者均可通过其各自的激酶活性参与调控细胞周期、细胞凋亡等生命活动,c-Abl与Plk1在DNA损伤应激反应中发挥作用均受ATM信号通路调节,且两者均可调控Rad51参与的基因同源重组修复过程,那么两者很可能具有一定的调控关系。本实验室在前期研究中发现,细胞中c-Abl及其同源基因Arg缺失时可引起微管蛋白的量明显下调,不能形成正常的微管结构,纺锤体组装出现缺陷,出现多核细胞,影响胞质分裂正常进行;当在细胞中过表达c-Abl和Plk1时,两种分子可以相互作用,因此我们研究这两者相互作用的具体机制及其在细胞中的生物效应,这将为研究c-Abl及Plk1在细胞周期调控中的作用提供新的理论依据。 本研究首先利用免疫共沉淀方法证明细胞内源性c-Abl和Plk1能够形成免疫复合物,又利用邻位连接技术更直观地证明在生理状态下,c-Abl和Plk1可以相互作用。利用免疫共沉淀方法证明过表达c-Abl和Plk1能够形成免疫复合物,并且主要依赖于c-Abl激酶活性,部分依赖Plk1激酶活性。GST-pulldown和FarWestern结果表明c-Abl与Plk1可直接相互作用,c-Abl可通过SH2、SH3结构域与Plk1结合,Plk1可通过PBD结构域与c-Abl和Arg结合;点突变和免疫共沉淀方法及GST-pulldown结果证明Plk1主要通过538位组氨酸和540位赖氨酸与c-Abl结合。通过免疫共沉淀和抗酪氨酸磷酸化抗体证明过表达c-Abl和Plk1时,c-Abl可以特异性磷酸化Plk1,并且酪氨酸磷酸化主要依赖c-Abl激酶活性,部分依赖Plk1激酶活性,Plk1KD结构域可以被c-Abl磷酸化。质谱分析数据表明,c-Abl可以磷酸化Plk1的Y203、Y217、Y268、Y570位点。 实验发现,c-Abl影响Plk1表达,当细胞中c-Abl/Arg双敲低或者双敲除时,Plk1表达降低,当恢复c-Abl/Arg双敲除细胞中c-Abl的表达时,Plk1的表达随之恢复,进一步发现,当在细胞中过表达c-Abl和Plk1时,c-Abl促进Plk1的表达。我们应用荧光定量PCR方法证明c-Abl不在转录水平促进Plk1表达;应用放线菌酮阻抑方法证明c-Abl可在转录后水平抑制Plk1降解。泛素化实验证明c-Abl依赖其激酶活性抑制Plk1通过泛素蛋白酶体途径降解。 Plk1表达与其激酶活性密切相关,为了证明c-Abl调控Plk1激酶活性,我们应用免疫共沉淀和p-Plk1T210抗体检测发现抑制内源性c-Abl激酶活性或者抑制过表达c-Abl激酶活性时,Plk1激酶活性降低。应用细胞周期同步化方法证明c-Abl可影响细胞周期中Plk1的p-Plk1T210的表达,并且进一步影响了Plk1对底物TCTP、CDC25C的磷酸化。 应用免疫荧光实验证明c-Abl不影响Plk1在细胞有丝分裂前期、前中期、中期、后期、末期中的定位。细胞周期同步化实验证明,c-Abl影响Plk1表达,从而影响细胞从G2末期到有丝分裂期的进入。活细胞实时成像结果证明,c-Abl激酶活性可以影响有丝分裂进程。 实验证明c-Abl与Plk1相互作用可以形成一种反馈机制,Plk1激酶反过来也能影响c-Abl表达。在一定范围内,细胞中过表达Plk1可促进内源性c-Abl表达并且呈剂量依赖关系;当Plk1表达量超出范围后,反过来又抑制c-Abl表达。应用荧光定量PCR方法证明Plk1是在转录水平促进c-Abl表达。 综上所述,本研究发现c-Abl与Plk1相互作用,c-Abl特异性磷酸化Plk1,调控Plk1表达及其激酶活性,c-Abl通过调节Plk1的表达及激酶活性影响G2/M期转换,c-Abl激酶活性影响有丝分裂进程。该研究对深入认识c-Abl和Plk1功能及两者在细胞周期G2/M转换及有丝分裂期的调控机制具有重要的理论意义。