鸡球虫病主要是由寄生在鸡肠道中的艾美尔球虫引发的一种严重限制养禽业发展的原生寄生虫病。其中,柔嫩艾美尔球虫（E.tenella）致病力最强,会引起肠道病变、严重阻碍鸡的生长发育。探索并掌握鸡球虫致病机理,明确机体抗球虫感染固有免疫应答机制对该病的预防和治疗具有重要意义。鸡Toll样受体15（ChTLR15）是一种禽类特有的位于细胞表面的模式识别受体,在鸡肠道病原感染中具有重要作用,但其配体和激活机制不清,在鸡球虫感染所致的肠道损伤中的作用也尚无报道。NLR家族热蛋白结构域3（NLRP3）炎性小体由传感器蛋白（NLRP3）、衔接蛋白（ASC）和半胱天冬酶（Caspase）组装而成,在介导炎症反应中起着重要的作用。近期有文献报道了NLRP3在寄生虫感染机制中的重要作用,但目前NLRP3在球虫感染过程中的作用机制研究尚无报道。NLRP3属于内源性分子,病原体不能直接激活,其上游信号转导分子也不明确。本试验通过体内E.tenella感染及体外细胞学试验,探索了E.tenella感染后ChTLR15和NLRP3信号通路以及信号通路相关分子的动态变化,阐明了子孢子对ChTLR15的特异性激活及其与NLRP3之间存在相关性。（1）首先将ChNLRP3前600个碱基（ChNLRP3-600）连接至原核表达质粒pET-30a（+）以构建重组pET30（a）-ChNLRP3-600质粒。将重组质粒转入大肠杆菌BL21中,使用IPTG诱导重组菌后经过SDS-PAGE方法检测蛋白表达情况。将纯化的蛋白免疫新西兰白兔以获得多克隆抗体。采用间接ELISA方法检测抗体的效价,采用Western blot方法检测多抗的特异性。结果表明,ChNLRP3-600在大肠杆菌中表达为包涵体蛋白,蛋白大小约为27 kDa。多克隆抗体效价为2¹⁷。Western blot结果表明兔抗ChNLRP3抗体能与鸡盲肠组织蛋白特异性反应。应用ChTLR15多肽片段对新西兰白兔进行免疫以制备ChTLR15多克隆抗体,结果表明效价达到2¹⁷,且能与鸡盲肠组织蛋白良好反应。兔源ChNLRP3和ChTLR15的特异性抗体为后续检测提供了必要材料。（2）为明确感染E.tenella的鸡盲肠组织中ChTLR15/ChMyD88/ChNF-κB/ChNLRP3/Caspase-1/ChIL-1β/ChIL-18通路中各各分子的表达情况,SPF雏鸡口服感染3×10⁴个/只、5×10³个/只两种剂量的E.tenella孢子化卵囊,感染后4、12、24、72 h取雏鸡盲肠组织,采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）、Western Blot和间接ELISA方法,对鸡盲肠组织中ChTLR15/ChMyD88/ChNF-κB/ChNLRP3/ChCaspase-1/ChIL-1β/ChIL-18通路中各分子的转录水平以及ChTLR15、ChNLRP3和ChIL-1β的蛋白表达进行检测。结果发现,E.tenella感染后72小时内能引起鸡盲肠组织中上述各分子表达极显著上调（p<0.001）,且动态变化大体一致。表明ChTLR15/ChMyD88/ChNF-κB/ChNLRP3/ChCaspase-1/ChIL-1β/ChIL-18信号通路在球虫感染过程中具有重要作用。（3）为进一步确定上述各分子在机体抗鸡球虫感染的先天免疫应答中的作用和关系,本研究对E.tenella子孢子体外刺激DF-1细胞0、2、4、6、8 h后ChTLR15/ChMyD88/ChNF-κB/ChNLRP3/ChCaspase-1/ChIL-1β/ChIL-18通路中各分子的转录水平以及ChTLR15、ChNLRP3和ChIL-1β的蛋白表达进行检测,结果发现E.tenella子孢子刺激DF-1细胞能引起各分子表达极显著上调（p<0.001）,各分子随时间变化而呈现出的动态变化趋势基本一致,且均于子孢子刺激后8 h达到顶峰。结果初步表明,E.tenella子孢子可以激活ChTLR15/ChMyD88/ChNF-κB/ChNLRP3/ChCaspase-1/ChIL-1β/ChIL-18信号通路。（4）采用RNAi技术对DF-1细胞中ChTLR15的表达进行干扰,通过对ChTLR15siRNA转染条件的优化,发现终浓度50 nM ChTLR15 siRNA转染24 h即可达到良好的沉默效果。E.tenella子孢子体外刺激ChTLR15低表达的DF-1细胞0、2、4、6、8 h后,对ChTLR15/ChMyD88/ChNF-κB/ChNLRP3/ChCaspase-1/ChIL-1β/ChIL-18通路中各分子的转录水平以及ChTLR15、ChNLRP3和ChIL-1β的蛋白表达进行检测。结果显示,相对于阴性ChTLR15 siRNA转染且不加子孢子刺激对照组,上述通路中各分子的表达水平极显著低于转染阴性siRNA且加子孢子刺激组（p<0.001）,各分子动态变化趋势基本一致。此外,将ChTLR15基因克隆入真核过表达载体pCMV,构建阳性重组质粒pCMV-ChTLR15,将鉴定正确的阳性质粒转染入DF-1细胞,Western Blot方法检测到转染后36 h ChTLR15蛋白表达量极显著上调（p<0.001）。对E.tenella子孢子体外刺激ChTLR15过表达的DF-1细胞后0、2、4、6、8 h的上述各分子的转录水平以及ChTLR15、ChNLRP3和ChIL-1β的蛋白表达水平进行检测。结果表明,上述各分子的表达量均极显著高于pCMV转染且不加子孢子刺激对照组和pCMV转染加子孢子刺激组（p<0.001）,且各分子动态变化趋势基本一致。上述结果清晰表明,E.tenella子孢子可特异性激活ChTLR15/ChMyD88/ChNF-κB信号通路,进而激活ChNLRP3/ChCaspase-1/ChIL-1β/ChIL-18通路。ChTLR15/ChMyD88/ChNF-κB/ChNLRP3/ChCaspase-1/ChIL-1β/ChIL-18通路在球虫感染早期所致的肠道炎性反应及损伤中扮演重要角色。综上,E.tenella可特异性激活ChTLR15及信号通路中关键分子ChMyD88和ChNF-κB,活化的ChTLR15进而激活ChNLRP3及通路相关分子参与机体抵抗鸡球虫感染所产生的先天免疫应答,诱导炎性因子ChIL-1β和ChIL-18的大量产生,介导球虫感染早期的炎症反应。ChTLR15与ChNLRP3信号通路间存在交叉对话。本研究为后续基于信号通路抑制剂研发新一代抗球虫制剂提供理论基础和参考。