肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是一种常见的、致死率极高的恶性肿瘤,每年约650,000人死于HCC,且其发病率有逐渐增高的趋势。HCC的转移是影响其术后治疗效果和预后的最大障碍,是导致HCC高死亡率的主要原因。HCC的转移主要是肝内转移,肝脏外部转移很少见。HCC的转移是一个连续、渐进的多因素、多步骤动态的过程。目前,尽管对HCC转移进行了大量研究,发现了一些与HCC转移相关的分子,但都是对某一分子与HCC转移的关系的研究,仅仅从某一个侧面证明了其与HCC转移的关系,并没有从整体上分析和了解HCC转移过程及其发生机制,所以HCC转移的分子机制并不清楚。　　前期研究发现Rab27B分子在高转移细胞株表达上调,因此可作为潜在的HCC转移标志物进行深层次的功能验证。Rab GTPase是机体内一组的与内膜运输相关的调节蛋白,其中Rab27亚族包括两个成员:Rab27A和Rab27B。Rab27B主要通过其效应分子的相互作用来发挥功能,其主要功能是参与大多数分泌性细胞的胞吐作用及运输过程。　　为了进一步研究Rab27B参与HCC转移的分子机制,我们采用RNAi技术抑制HCC细胞系中Rab27B的表达,以确定其是否与HCC转移相关,并探索其参与HCC转移的机制,在此基础上通过临床样本验证其能否作为诊断HCC转移的候选标志物。本研究选取具有较高转移能力的HCC细胞株HCC97H作为细胞模型,首先通过构建针对Rab27B的特异性的shRNA质粒载体,通过转染HCC97H,筛选到特异性抑制Rab27B表达的shRNA,并经G418筛选得到稳定敲低Rab27B的HCC97H细胞株-shRab27B细胞株,与此同时也得到阴性对照稳定细胞株-mock细胞株,通过RT-PCR及Western Bloting鉴定其Rab27B的表达水平与正常HCC97H细胞相比显著下降。　　HCC的转移过程中涉及到细胞的增殖、黏附、迁移和侵袭等方面的性质,因此本研究也从这几个方面进行。首先,在体外通过实验比较shRab27B、mock和HCC97H细胞株的增殖、黏附、迁移和侵袭能力,结果显示稳定敲低Rab27B的HCC97H细胞株shRab27B细胞与mock及HCC97H细胞相比,其体外贴壁增殖、黏附、迁移和侵袭能力均显著下降,这说明Rab27B表达量的降低抑制细胞的转移过程,也即体外实验证明Rab27B与HCC的转移过程相关。随后,进一步通过体内实验即裸鼠荷瘤转移模型进行验证,通过向裸鼠脾脏接种shRab27B和mock细胞,观察肿瘤的肝脏转移及肺脏转移情况,接种细胞8周后mock组肝脏肿瘤转移灶质量要显著大于shRab27B组,且接种shRab27B组肝脏转移灶出现的时间要显著晚于mock组的出现时间,这表明Rab27B表达的降低抑制了HCC97H细胞的裸鼠体内的转移和侵袭能力。通过体内外实验确定Rab27B与HCC的转移相关。　　在确定Rab27B与HCC转移相关的基础上,进一步探讨其参与HCC转移的机制,即其是如何调控HCC转移过程的。Rab27B主要参与调控细胞的囊泡运输过程,在细胞内囊泡定位运输至胞膜的过程中发挥了重要作用,因此,我们推断Rab27B表达量的降低抑制了HCC97H细胞的囊泡分泌过程,从而降低了参与HCC转移的重要分子的分泌量。经过实验验证,可知在胞外分泌蛋白中,shRab27B细胞分泌的尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)和肝细胞生长因子(HGF)的量与mock和HCC97H细胞相比显著下降,uPA和HGF及其受体在肿瘤的转移过程中发挥了重要的作用。因此,我们确定HCC97H细胞中Rab27B表达量的降低抑制了uPA和HGF的分泌过程,从而抑制了HCC97H细胞的转移过程。　　随后收集不同时期HCC病人临床血清,通过ELISA实验测定Rab27B的表达量,在已发生转移的HCC病人血清中Rab27B的含量要显著高于未发生转移的,因此Rab27B可作为诊断HCC转移的潜在标志物用于临床诊断。　　本课题采用RNAi技术建立稳定敲低Rab27B表达水平的HCC97H细胞株,通过体内外实验确证Rab27B与HCC转移的相关性,并初步探讨了Rab27B参与HCC转移的分子机制:Rab27B通过调节肿瘤细胞的囊泡运输过程,影响一些参与HCC转移的蛋白的分泌过程,从而参与HCC的转移过程。囊泡运输参与肿瘤转移的线索,为深入探究HCC的转移机制奠定基础。随后,通过检测不同时期的HCC病人血清和组织样本中Rab27B的表达量,Rab27B可作为诊断HCC转移的潜在的标志物,具有一定的临床应用前景。