研究背景乳腺癌（Breast Cancer,BC）是全世界女性各种癌症中发病率和死亡率都占居首位的癌症,严重威胁女性的生命安全和生活质量。乳腺癌的发病受多种因素影响,包括体内雌激素水平、易感基因变异、生活环境及生活方式、营养等。乳腺癌治疗策略主要以外科手术切除为主,同时辅以放射治疗（Radiationg therapy,RT）,化学疗法（Chemotherapy,CT）,内分泌治疗（Endocrine therapy,ET）及靶向治疗（Targeted therapy,TT）等,抗肿瘤药物可单独使用或组合使用从而降低乳腺癌复发的风险。精准治疗是近年来的发展趋势,乳腺癌的精准治疗与其分子分型关系密切,按照关键蛋白雌激素受体（Estrogen receptor,ER）、孕激素受体（Progesterone receptor,PR）、人表表皮生长因子受体2（Human epidermal growth factor receptor2,HER2）和增殖标记物 Ki67 的表达情况,乳腺癌分为 4 个亚型,分别是:Luminal A 样、Luminal B 样（HER2-/HER2+）、HER2+和三阴乳腺癌（Triple negative breast cancer,TNBC）。大约70%的乳腺癌患者的癌细胞中雌激素受体为阳性,并且依赖该激素受体扩增,因此雌激素受体被作为乳腺癌激素疗法的理想靶点。他莫昔芬（Tamoxifen,TAM）是最常用的治疗雌激素受体阳性乳腺癌的内分泌治疗药物。早期雌激素受体阳性乳腺癌,用TAM辅助内分泌治疗5年可使肿瘤的复发率减半,使年度乳腺癌相关死亡率减少三分之一。然而,尽管使用了 TAM治疗,仍会有三分之一的患者会在15年内复发,这说明“耐药”仍然是乳腺癌治疗中的一个难题。由此可见,进一步阐明乳腺癌耐药的分子机制是临床提高TAM疗效亟待解决的问题。TAM耐药机制复杂,包括ER结构、激活和功能异常,以及雌激素信号网络和其他细胞途径之间的调节异常。长链非编码RNAs（Long non-coding RNAs,LncRNAs）广泛参与各种肿瘤的发生发展,并且与肿瘤细胞耐药有关,是近些年肿瘤研究领域的热点。LncRNAs作为竞争性内源RNA,通过海绵micro RNAs（miRNAs）调控肿瘤的耐药。本课题收集乳腺癌病人的乳腺癌组织和癌旁组织,进行RNA基因芯片检测分析,寻找差异表达的LncRNAs。经过逆转录实时荧光定量聚合酶链反应法（Reverse transcription quantitative poLymerase reaction,RT-qPCR）验证,发现LncRNA肝细胞核因子1同源框A反义RAN 1（Hepatocyte nuclear factor 1 homeobox A-antisense RNA 1,HNF1A-AS1）在两组组织中表达差异最大。后经细胞实验发现HNF1A-AS1在TAM耐药乳腺癌细胞中的表达显著升高。目前关于HNF1A-AS1参与TAM耐药的机制还未见报道。本课题通过体外细胞实验研究了HNF1A-AS1、HNF1A-AS1的竞争性miRNA-miR-363和miR-363的靶标基因SERTAD3与TAM耐药的关系。通过体内动物实验研究沉默HNF1A-AS1对乳腺癌移植瘤生长以及对TAM治疗敏感性的影响。本课题通过沉默或过表达HNF1A-AS1、miR-363和SERTAD3,使用细胞和动物实验研究其在TAM耐药中的作用机制,以期改善TAM治疗疗效,并有助于开发新的治疗策略,克服乳腺癌TAM耐药。本课题主要分为以下三个部分:第一部分HNF1A-AS1在乳腺癌组织中的表达及其与乳腺癌患者预后的关系研究目的1.分析乳腺癌组织中差异表达的LncRNAs。2.测定乳腺癌组织中5个上调的LncRNAs的表达水平。3.探讨LncRNAHNF1A-AS1与乳腺癌患者生存预后的关系。方法1.乳腺癌组织标本:收集2017年5月至2018年5月在郑州大学第三附属医院82例未经过放疗、化疗或者内分泌治疗的行乳腺癌切除患者的乳腺癌组织（病例组）以及癌旁组织（对照组）。2.收集病人详细的临床资料,包括患者年龄、肿瘤直径、临床分期、淋巴结(Lymph node metastasis,LNM转移情况、ER、PR和Ki-67 的表达情况。3.采用RNA基因芯片检测分析4例病例组和对照组中差异表达的LncRNAs,对在乳腺癌中上调的前5位LncRNAs采用RT-qPCR进行验证检测。在癌症基因组图谱（The Cancer Genome AtLas,TCGA）数据库中检索HNF1A-AS1与乳腺癌患者生存率的相关性。4.采用SPSS 21.0和GraphPad Prism 5.0软件进行数据的统计和分析,所有数据计量资料均采用x±s表示,数据行正态性检验。两组间数据比较分别采用独立样本t检验和配对样本t检验。采用KapLan Meier法对乳腺癌患者进行生存预后分析。以α=0.05作为检验水准。结果1.RNA基因芯片研究乳腺癌Lnc RNAs差异表达情况经RNA基因芯片检测分析,发现143个差异表达的LncRNAs,其中54个LncRNAs在病例组中表达上调,89个下调。2.RT-qPCR检测五个Lnc RNAs的相对表达量选取基因芯片分析表达上调前5位的LncRNAs:HNF1A-AS1、CCAT2、CCHE1、LINC01540和HOXA-AS3,使用RT-qPCR检测其在病例组和对照组中的表达情况。HNF1A-AS1在病例组中的相对表达量为5.65±1.23,高于对照组的1.12±0.78,差异具有显著统计学意义（P＜0.01）;CCAT2在病例组中的相对表达量为6.03±1.34,高于对照组的4.68±0.87,差异具有统计学意义（P＜0.05）;CCHE1在病例组中的相对表达量为5.27±1.30,高于对照组的4.98±0.91,差异具有统计学意义（P＜0.05）;LINC01540在病例组中的相对表达量为4.85±0.92,高于对照组的3.98±0.75,差异具有统计学意义（P＜0.05）;HOXA-AS3在病例组中的相对表达量为4.76±1.02,高于对照组的2.60±0.61,差异具有统计学意义（P＜0.05）。HNF1A-AS1在两组中表达差异最大（P＜0.01）。并且TCGA数据库中显示高表达HNF1A-AS1的BC患者生存率较低。因此本课题重点关注HNF1A-AS1。3.HNF1A-AS1的表达与乳腺癌患者预后的相关性以乳腺癌组织中HNF1A-AS1表达的中位数为界限值,将乳腺癌患者分为高表达组（≥6.11,n=40例）和低表达组（＜6.11,n=42例）,分析HNF1A-AS1的表达与乳腺癌患者预后的相关性。研究发现高表达HNF1A-AS1的乳腺癌患者的临床分期更晚,淋巴结转移率、PR、ER和Ki-67的阳性率均高于低表达组（P＜0.05）,但是与患者的年龄和肿瘤大小无相关性（P＞0.05）。小结HNF1A-AS1在乳腺癌组织中高表达,且与乳腺癌患者的预后呈负相关性。第二部分:HNF1A-AS1通过miR-363/SERTAD3调控乳腺癌细胞增殖和他莫昔芬耐药的体外研究目的1.探讨沉默HNF1A-AS1对乳腺癌细胞和TAM耐药细胞增殖和凋亡的影响。2.探讨沉默或过表达HNF1A-AS1、miR-363和SERTAD3对TAM耐药细胞的影响。3.探讨沉默或过表达HNF1A-AS1、miR-363 和SERTAD3 通过TGF-β/Smad3通路参与TAM耐药。方法1.采用RT-qPCR检测HNF1A-AS1在人正常乳腺上皮细胞系MCF-10A、乳腺癌细胞系MCF-7、BT474、ZR-75-30、MDA-MB-231、HCC1937 和MDA-MB-436中的表达情况。2.转染HNF1A-AS1siRNA载体si-HAS1-1 和si-HAS 1-2,以及siRNA空白载体（si-NC）到MCF-7和BT474细胞,分别分为3组:si-NC组、si-HAS1-1组和si-HAS1-2 组。采用 3-（4,5-dimethylthiazol-2-yl）-2,5-diphenyltetrazolium bromide（MTT）、5-ethynyl-2’-deoxyuridine（EdU）、克隆形成实验以及流式细胞实验,检测MCF-7、BT474乳腺癌细胞的增殖和凋亡情况。3.构建TAM耐药细胞系MCF-7/TAM,采用MTT鉴定乳腺癌细胞对TAM的耐药性;采用RT-qPCR方法检测HNF1A-AS1在他莫昔芬耐药细胞株MCF-7/TAM中的表达情况;转染HNF1A-AS1 siRNA载体si-HAS1-1和si-HAS1-2,以及siRNA空白载体（si-NC）到MCF-7/TAM,采用MTT和Hoechst实验检测耐药细胞对TAM的敏感性以及增殖活性。4.转染HNF1A-AS1过表达质粒和NC阴性对照质粒到MCF-7和BT474细胞中,分别分为2组:Control组和HAS1组。采用Hoechst染色实验检测乳腺癌细胞的增殖活性,采用MTT实验检测乳腺癌细胞对TAM的敏感性。采用在线数据库StarBase 和 miRcode Pearson分析 HNF1A-AS1 与miR-363 的靶向关系,通过双荧光素酶报告基因实验证实HNF1A-AS1与miR-363的靶向关系。采用RT-qPCR方法检测miR-363在乳腺癌组织、MCF-7、BT474和耐药细胞系MCF-7/TAM中的表达情况。通过TargetScan、StarBase和miRTarBase软件分析miR-363和SERTAD3的靶向关系,通过双荧光素酶报告基因实验进一步证实miR-363和SERTAD3的靶向关系。采用RT-qPCR方法检测SERTAD3在乳腺癌组织中的表达。5.转染miR-363模拟物到MCF-7 HAS1组乳腺癌细胞,实验分为2组:共转染HAS1+mimics NC组（HAS1+NC组）和共转染HAS1+miR-363 mimics组（HAS1+miR-363组）,使用MTT检测比较两组细胞对TAM的敏感性。在MCF7细胞和MCF/TAM+si HAS1-1组细胞中导入SERTAD3过表达载体和空白载体（Empty Vectors）,分为 4 组:MCF7 细胞 Empty Vectors组和SERTAD3 组,MCF/TAM细胞si HAS1-1+Empty Vectors组和si HAS1-1+SERTAD3 组,使用MTT检测比较4组细胞对TAM耐药性的影响。6.采用Western blot检测TGF-β/Smad3信号传导通路中TGF-β、总Smad3和磷酸化Smad3在沉默或者过表达HNF1A-AS1、miR-363、SERTAD3的乳腺癌细胞系中的表达情况。7.采用SPSS 21.0和GraphPad Prism 5.0软件进行数据的统计和分析,所有数据计量资料均采用x±s表示,数据行正态性检验。两组间数据比较采用独立样本t检验。以α=0.05作为检验水准。结果1.HNF1A-AS1在乳腺癌细胞系中的表达情况HNF1A-AS1在乳腺癌细胞系中的相对表达量分别为:MCF-7（3.61±0.32）、BT474（4.12±0.41）、ZR-75-30（2.14±0.23）、MDA-MB-231（3.25±0.30）、HCC1937（2.21±0.19）和MDA-MB-436（2.67±0.21）,均高于在MCF-10A中的表达,差异具有统计学意义（P＜0.05）。对比发现HNF1A-AS1在MCF-7和BT474细胞中表达较高,选择MCF-7和BT474细胞系进行HNF1A-AS1后续相关干预实验。2.沉默HNF1A-AS1对乳腺癌细胞增殖和凋亡的影响2.1 MTT、EdU、克隆形成实验发现,MCF-7和BT474细胞si-HAS1-1组和si-HAS1-2组乳腺癌细胞的增殖能力、DNA复制能力以及克隆形成能力均较si-NC组下降,差异具有统计学意义（P＜0.05）。2.2 流式细胞实验结果显示,MCF-7细胞si-HAS1-1组和si-HAS1-2组细胞的凋亡率（%）分别为21.12±0.42和21.98±0.56,明显高于si-NC组的9.04±0.42;BT474细胞si-HAS1-1组和si-HAS1-2组的凋亡率（%）分别为22.11±0.46和23.94±0.45,显著高于si-NC组的11.35±0.21,差异具有统计学意义（P＜0.01）。3.沉默HNF1A-AS1对TAM耐药细胞增殖和药物敏感性的影响3.1采用低浓度的TAM诱导耐药细胞系MCF-7/TAM,使用MTT实验表明MCF-7细胞他莫昔芬IC50值（20μg/mL）明显低于MCF-7/TAM,差异具有统计学意义（P＜0.05）,证实TAM的耐药细胞系MCF-7/TAM构建成功。3.2与MCF-7细胞相比,耐药细胞系MCF-7/TAM中HNF1A-AS1的相对表达升高（5.98±0.64）,差异具有统计学意义（P＜0.01）。3.3 Hoechst实验表明,si-HAS1-1 组和si-HAS1-2 组MCF-7/TAM细胞的增殖能力较si-NC组显著降低,MTT实验表明si-HAS1-1组和si-HAS1-2组MCF-7/TAM细胞对TAM的敏感性显著增加,差异均具有统计学意义（P＜0.05）。4.HNF1A-AS1调控miR-363/SERTAD3对乳腺癌细胞TAM耐药的影响4.1 RT-qPCR结果表明,转染HNF1A-AS1过表达质粒的MCF-7和BT474细胞HAS1组与Control组相比,HNF1A-AS1的表达显著升高,差异均具有统计学意义（P＜0.01）。MTT实验表明MCF-7和BT474细胞HAS1组与Control组相比,乳腺癌细胞对TAM的耐药性增加,敏感性降低,差异具有统计学意义（P＜0.05）。Hoechst实验结果表明MCF-7和BT474细胞HAS1组与Control组相比,细胞的增殖能力显著上调,差异具有统计学意义（P＜0.05）。4.2 采用在线数据库StarBase和miRcode Pearson预测HNF1A-AS1的潜在靶标miR-363,双荧光素酶报告基因实验进一步证实HNF1A-AS与miR-363结合,存在靶向关系。4.3 miR-363在乳腺癌组织较正常对照组中的相对表达量降低,分别为1.05±0.23 vs 3.16±1.28,差异具有统计学意义（P＜0.01）。miR-363在乳腺癌耐药细胞MCF-7/TAM中的相对表达量（0.42±0.07）显著低于非耐药细胞系MCF-7,差异均具有统计学意义（P＜0.01）。4.4 miR-363 在MCF-7/TAM细胞si-HAS1-1 和si-HAS1-2 组中的相对表达（分别为:2.64±0.41和2.49±0.26）较si-NC组明显升高,差异均具有统计学意义（P＜0.01）。而miR-363在MCF-7和BT474细胞HAS1组中的相对表达（分别为0.43±0.07和0.48±0.06）较Control组则明显降低,差异均具有统计学意义（P＜0.01）。4.5 在TargetScan,StarBase和miRTarBase数据库中筛选miR-363 靶基因SERTAD3,双荧光素酶报告基因实验证实miR-363可与SERTAD3靶向结合。SERTAD3在乳腺癌组织较正常组织中表达增高（3.21±1.15vs1.74±0.62）,差异具有统计学意义（P＜0.01）。5.沉默或过表达HNF1A-AS1、miR-363 和 SERTAD3 通过TGF-β/Smad3 通路参与乳腺癌TAM耐药5.1 MTT实验结果表明,MCF7细胞共转染HAS1+miR-363组较HAS1+NC组对TAM的敏感性显著增加,两组TAM的IC50值分别为78μg/mL vs 20μg/mL,差异具有统计学意义（P＜0.05）。Hoechst实验结果表明HAS1+miR-363组MCF7细胞较HAS1+NC组增殖能力较显著降低,差异具有统计学意义（P＜0.05）。5.2 在MCF-7和MCF-7/TAM si-HAS1-1组细胞中共转染SERTAD3表达载体,MTT实验实验结果表明,MCF-7细胞SERTAD3组较Empty Vectors组,细胞对TAM的抗性增加,两组TAM的IC50值分别为79μg/mL vs 20μg/mL,差异具有统计学意义（P＜0.05）;MCF-7/TAM细胞si-HAS1-1+SERTAD3 组较si-HAS1-1+Empty Vectors组对TAM的抗性增加,两组TAM的IC50值分别为92μg/mL vs 40μg/mL,差异具有统计学意义（P＜0.05）。5.3 Western blot结果显示,在MCF-7/TAM细胞si-HAS1-1组、si-HAS1-2组和si-NC对照组中,TGF-β在si-HAS1-1组和si-HAS1-2组中的相对表达量（0.17±0.02和0.18±0.02）低于si-NC对照组（0.48±0.08）,差异具有统计学意义（P＜0.01）。总Smad3（t-Smad3）在si-HAS1-1 组和si-HAS1-2 组中的表达量（0.49±0.07 和 0.50±0.08）与si-NC对照组（0.52±0.08）无明显差异,磷酸化Smad3（p-Smad3）在si-HAS1-1 组和si-HAS1-2 组中的表达量（0.21±0.06 和 0.23±0.05）低于si-NC组（0.42±0.06）,差异具有统计学意义（P＜0.01）。但是在MCF-7/TAM si HAS1-1组细胞中导入外源性的SERTAD3后,MCF-7/TAM细胞si HAS1-1+SERTAD3细胞中TGF-β的表达量又明显升高（0.34±0.07）,t-Smad3的表达量无明显差异（0.523±0.08）,p-Smad3表达量也明显升高（0.38±0.06）,差异具有统计学意义（P＜0.01）。在MCF-7 细胞control组、HAS1 组、HAS1+miR-363 组和SERTAD3 组中,Westrn blot检测,结果提示HAS1组中TGF-β的蛋白表达量（0.38±0.04）高于Control组（0.22±0.08）,SERTAD 3 组中TGF-β的蛋白表达量（0.41±0.07）高于HAS1+miR-363 组（0.31±0.03）,差异均具有统计学意义（P＜0.01）;t-Smad3 在4组细胞中的表达无明显变化,分别为0.39±0.04、0.41±0.06、0.40±0.06、0.47±0.09;p-Smad3 在HAS1 组中的蛋白表达量（0.40±0.06）高于Control组（0.23±0.04）,差异具有统计学意义（P＜0.01）,SERTAD3组中p-Smad3的蛋白表达量（0.42±0.05）高于HAS1+miR-363组（0.31±0.04）,差异具有统计学意义（P＜0.01）。小结HNF1A-AS1竞争结合miR-363,调控SERTAD3的表达,参与乳腺癌细胞的增殖和他莫昔芬耐药。第三部分 HNF1A-AS1影响乳腺癌移植瘤生长及他莫昔芬疗效的体内实验研究目的本部分通过构建乳腺癌裸鼠移植瘤动物模型,在上述研究的基础上进一步探讨沉默HNF1A-AS1能否在体内抑制肿瘤的生长,增加TAM的治疗敏感性。方法1.建立乳腺癌裸鼠动物模型:选取20只雌性BALB/c裸鼠随机分为4组,每组5只,分别为:si-NC组（植入MCF-7 si-NC组细胞）、si-HAS1-1组（植入MCF-7 si-HAS1-1组的细胞）、si-NC+TAM组（植入MCF-7 si-NC组细胞,腹腔注射TAM）、si-HAS 1-1+TAM组（植入MCF-7 si-HAS1-1 组的细胞,腹腔注射TAM）。2.每只小鼠通过腋窝乳腺注射转染si-NC和si-HAS1-1的MCF7细胞悬液。3.注射后定期监测皮下肿瘤的生长情况。当肿瘤直径达4-5mm时,对si-NC+TAM组和si-HNF1A-AS1+TAM组小鼠腹腔注射TAM,剂量 20mg/kg,每三天注射一次,共注射5次,同时用游标尺检测皮下肿瘤的长直径（a）和短直径（b）,计算肿瘤体积（V）,V=a*b2/2。4.注射5次后,对小鼠实施安乐死,取出乳腺癌瘤体,测量体积并称重,根据测量的瘤体体积绘制肿瘤生长曲线。5.采用免疫组化法检测乳腺移植瘤体细胞Ki-67的表达。6.采用SPSS 21.0软件进行数据的统计和分析,所有数据计量资料均采用x±s表示,数据行正态性检验。两组间数据比较采用独立样本t检验。以α=0.05作为检验水准。结果1.沉默HNF1A-AS对裸鼠移植瘤生长及对TAM治疗敏感性的影响si-HAS1-1组裸鼠种植瘤的体积和重量均小于si-NC组,si-HAS 1-1+TAM组裸鼠种植瘤的体积和重量小于si-NC+TAM组,差异具有统计学意义（P＜0.05）。2.移植瘤细胞Ki67的表达情况Ki-67的免疫组化结果提示,si-HAS1-1组肿瘤中Ki-67阳性细胞率0.41±0.05较si-NC组降低,si-HAS 1-1+TAM组肿瘤中Ki-67阳性细胞率0.26±0.08较si-NC+TAM组降低,差异具有统计学意义（P＜0.05）。小结沉默HNF1A-AS1可抑制乳腺癌移植瘤的生长,增加TAM治疗的敏感性。全文结论1.长链非编码RNA HNF1A-AS1与乳腺癌患者生存预后存在负相关性。2.HNF1A-AS1竞争结合miR-363,调控SERTAD3的表达,参与乳腺癌细胞的增殖和他莫昔芬耐药。沉默HNF1A-AS1可抑制乳腺癌移植瘤的生长,增加肿瘤对TAM治疗的敏感性。