血浆蛋白组分纯化与鉴定的新策略及相互作用的新发现——用噬菌体抗体研究血浆蛋白组的新策略及潜在活性形态纤溶酶原激活物抑制剂-1抑制尿激酶原溶栓作用机制的新理论

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人血浆蛋白组是蛋白质组学研究中最重要的蛋白组之一。自从HUPO的HPPP计划开展以来,大量的血浆蛋白组分被成功鉴定,但是大部分蛋白质依然无法有效地从血浆中纯化出来。本文的工作目的在于探索一种新的策略,能够迅速寻找血浆蛋白组中的纯组分的亲和配体,并将其从血浆中纯化出来且予以鉴定。  本文选择已经将HSA和IgG分离的血浆蛋白组作为研究对象,采用了噬菌体抗体库对整个蛋白组进行筛选的策略。噬菌体抗体库是获取亲和配体的常用手段,然而在本文之前的研究通常是采用噬菌体抗体库对纯抗原进行筛选,或者是针对若干组复杂抗原在组分的种类或表达量上的差异进行筛选。像本文这样针对一组各组分彼此独立且难以分离的复杂抗原进行无差异性的筛选尚属首次。  在本文的筛选策略中,交联噬菌体技术是保证整个策略得以方便快捷进行的重要环节。本文的研究首次对噬菌体抗体进行了交联,使其成为真正意义上配体与载体的统一体,是真正可用的亲和基质。使用交联的噬菌体抗体对抗原进行纯化,不仅简化了重组表达scFv的繁琐工作,同时避免了配体的亲和力缺失。  在筛选过程是在溶液中进行的,采用了生物素标记抗原—亲和素吸附的模式。在进行了3轮筛选之后,从次级抗体库中挑选出了9个阳性单克隆,其中的6个被制备成了交联噬菌体,并直接用于血浆蛋白组分的纯化。本文用PST方法对被纯化出的血浆蛋白组分进行了鉴定,得到了明确的纯蛋白。  本文的工作展示了将抗体库直接应用于蛋白质组水平的筛选是完全可能的。本文描述了一种能够批次获得多组分体系中各纯组分的亲和配体的策略,并应用于血浆蛋白组分的纯化与鉴定。这为血浆蛋白组学的研究提供了一条新的思路,为迅速分离与鉴定包括低丰度蛋白和未知蛋白在内的血浆蛋白组分建立了一种新的方法。在方法学意义上,本文首次报道了“组对组”筛选模式,其中包括对噬菌体抗体的交联及其在蛋白组研究中的应用。  此外,本文还描述了一种PAI-1和proUK之间的相互作用,用以解释临床试验中proUK溶栓无法开通的现象。在过去的研究中,普遍的观点认为只有active形式的PAI-1与proUK的双链形式UK存在共价结合与抑制作用,latent形式的PAI-1对proUK与UK不存在相互作用。同时active形式的PAI-1是否与proUK有相互作用一直存在争议。本文的研究首次发现,active与latent形式的PAI-1均能与proUK产生非共价的可逆结合,而与proUK结合后的PAI-1则全部是latent形式。同时本文的研究还发现PAI-1与proUK的结合影响了proUK激活plasminogen的过程,进一步的研究发现,PAI-1对proUK活力的影响是抑制了proUK向UK转化的过程。本文认为,临床试验中部分病例使用proUK溶栓效率低下的原因是这些病例体内的血浆PAI-1水平高出正常人群,过量的PAI-1通过阻碍proUK向UK转化使得proUK的溶栓进程变慢。本文进行了分子实验和proUK体外溶栓实验研究,并调查了36个肥胖个体与20个正常个体的临床血样,为本文描述的机制提供了证据。
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