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目的:研究确定不同栽培环境下的霍山石斛内生真菌的种类、优势种/属以及组织分布,优选出抗病原真菌的优势种/属,探索其次生代谢产物,以期得到与寄主植物相似或相同的活性化合物,甚至得到结构新颖、生物活性较高的先导化合物,为今后有利于实现道地药材霍山石斛资源的可持续发展及质量控制奠定科学基础。方法:运用经典组织块分离法和分子生物学手段对不同栽培环境下霍山石斛内生真菌进行分离鉴定,基于生物统计学原理对所分离得到的内生真菌进行多样性和群落结构分析。采用十字交叉法筛选出抗病原真菌活性较好的优势菌株,并对其液体发酵,将所得发酵液运用各种色谱方法和现代波谱技术进行分离鉴定。结果:从7处不同栽培环境下霍山石斛中共分离得到168株内生真菌,分属18属36种,其中丰富度指数、均一度指数以及多样性指数表明圣农基地的木屑栽培下霍山石斛内生真菌种类多样丰富且在霍山石斛不同组织中,茎中分离得到的内生真菌亦比根和叶中物种丰富。168株内生真菌中Stagonosporopsis oculiho minis,Alternaria eichhorniae,Phyllosticta aristolochiicola,Aspergillus flavus,Fusarium lactis这5株真菌为优势菌株。菌株活性筛选实验表明:菌种Aspergillus flavus乙酸乙酯萃取液对10种病原真菌抑菌效果最差,其他4种菌种乙酸乙酯萃取液对10种病原菌效果各有优劣,其中菌种Stagonosporopsis oculihominis对10种病原真菌平均抑菌率达到50%以上,尤其是对油菜菌核抑菌率高达90%;Alternaria eichhorniae相比其他菌种对三种石斛致病菌都有一定的抑菌率,且高于其他病原真菌抑菌率;Fusariu m lactis对立枯丝核病原真菌抑菌率达到了100%。从三种活性较好的菌株Alternaria eichhorniae、Stagonosporopsis oculihominis和Fusarium lactis中分离并鉴定74个单体化合物。其中Stagonosporopsis oculihominis菌中分离得到36个化合物依次:stagonoculiepine(1),stagonoculiazin(2),acetyl-L-isoleucine(3),N-(4-戊氧基)乙酰胺(4),(E)-4-(4-hydroxyphenyl)but-3-en-2-one(5),对羟基苯乙醇(6),对羟基苯乙酸(7),Nb-乙酰基色胺(8),N-isobutylacetamide(9),琥珀酸乙酯(10),环-(D)-丙氨酸-(L)-脯氨酸(11),尿嘧啶(12),环(L)-脯氨酸-(L)-苯丙氨酸(13),环(D)-脯氨酸-(L)-苯丙氨酸(14),1H-indole-3-carboxylic acid(15),2-(1H-indol-3-yl)acetic acid(16),腺嘌呤核苷(17),5-methoxydaidzein(18),环(L)-脯氨酸-(L)-缬氨酸(19),环(L)-脯氨酸-(D)-缬氨酸(20),环(L)-脯氨酸-(L)-异亮氨酸(21),环(L)-脯氨酸-(D)-亮氨酸(22),环(L)-脯氨酸-(L)-亮氨酸(23),Cyclo[D-(4-hydroxyprolinyl)-L-leucine(24),Cyclo[L-(4-hydroxyprolinyl)-L-leucine(25),环(L)-脯氨酸-(L)-脯氨酸(26),环(L)-酪氨酸-(L)-脯氨酸(27),环(L)-苯丙氨酸-(L)-亮氨酸(28),环(L)-4-OH-脯氨酸-(L)-苯丙氨酸(29),油酸(30),α-亚油酸脂油酸(31),8(E)-十六烯酸(32),亚麻酸(33),α-亚油酸脂(34),22E-7αmethoxy-5α,6α-epoxyergosta-8(14),22-dien-3β-ol(35),demethylincisterol(36)。Alternaria eichhorniae菌中分离得到17个化合物依次是:对羟基苯乙酸(37),(2S,3R)-1-苯基-2,3-丁二醇(38),对羟基苯乙醇(39),3-hydroxy-4-(4-hydroxyphenyl)-2-butanone(40),(2R,3S)-1-(4-hydroxyphenyl)butane-2,3-diol(41),tricycloalternarenes 6b(42),tricycloalternarenes 1b(43),tricycloalternarenes H(44),tricycloalternarenes 1a(45),tricycloalternarenes 2a(46),Nb-乙酰基色胺(47),环(脯-苯丙)氨酸(48),altertoxins I(49),stemphyperylenol(50),alterperylenol(51),melithasterol B(52),(22E,24R)-3β,5α,9α-Trihydroxyergosta-7,22-dien-6-one(53);Fusarium lactis菌中分离得到21个化合物依次是:N-苯乙基乙酰胺(54),1H-indole-3-carbaldehyde(55),胸腺嘧啶(56),尿嘧啶(57),lignoren(58),尿嘧啶核苷(59),己六醇(60),腺嘌呤核苷(61),环-甘氨酸-(L)-脯氨酸(62),环(D)-脯氨酸-(L)-苯丙氨酸(63),环(L)-脯氨酸-(L)-苯丙氨酸(64),2-pyrrolidinone(65),N-methyl-2-pyrolidinone(66),环(L)-4-OH-脯氨酸-(L)-苯丙氨酸(67),brevianamide F(68),3-甲基哌嗪-2,5-二酮(69),7,8-dimethylbenzo[g]pteridine-2,4(1H,3H)-dione(70),环(L)-酪氨酸-(L)-苯丙氨酸(71),啤酒甾醇(72),大豆黄素(73),赤藓糖醇(74)。结论:7处不同栽培环境下霍山石斛内生真菌群落结构多样丰富,不同生境下霍山石斛内生真菌种类不一,霍山石斛不同组织部位内生真菌亦存在差异性;霍山石斛内优势种属的内生真菌抗病原真菌具有广谱性,且大多数对石斛致病菌具有较好的抑菌效果。从三株内生真菌次生代谢产物中分离得到74个单体化合物,其中64个不同化合物,化合物1-2为新化合物,化合物3为新天然产物,上述所分得化合物均首次从三株内生真菌中分离得到。