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天然免疫反应系统在抵抗乙型肝炎病毒(HBV)感染中发挥重要作用。作为肝脏最主要的组成,肝细胞在肝脏免疫调控中可能发挥了主导作用。本课题研究了 HBV蛋白表达对肝细胞/肝癌细胞炎性反应的调控及其作用机制,为阐明HBV蛋白与肝细胞在肝脏疾病发生发展过程中的作用提供了研究基础。研究方法1、构建HBV蛋白表达重组载体,转染肝细胞/肝癌细胞。通过荧光PCR研究肝细胞/肝癌细胞内炎性效应分子在转录水平上的表达变化趋势,利用酶联免疫吸附试验(ELISA)和免疫印迹试验(Western Blot)来研究炎性效应分子在蛋白水平的表达变化情况;2、利用Western Blot和免疫荧光试验,借助特异的信号通路抑制剂,研究HBV蛋白引起的炎性效应中涉及到的信号通路及其作用;3、构建HBV核心抗原(HBc)稳转细胞株,检测HBc在细胞增殖中的作用;4、转染siRNA研究肝癌细胞内HMGB1在HBc促细胞增殖过程中的作用,结合Western Blot技术,研究涉及到的信号通路。研究结果1、HBV 大蛋白(LHBs)和 HBc 能够上调 AIM2、IL-1β、IL-18、IL-6和TN αmRNA等炎性基因的表达;中蛋白(MHBs)能够上调AIM2、IL-6和TNFα mRNA的表达;小蛋白(SHBs)除引起TNFα表达量上调外,对其它基因的表达无影响。在SMMC-7721、L-02和Huh7细胞中,LHBs、HBc和MHBs组IL-6表达量上调且在24小时达到高值。在HepG2和SMMC-7721细胞中,MHBs和HBc组TNFα表达量在转染6小时时达到高值,随后下降,在Huh7和L-02细胞中,变化趋势与此相反。在Huh7细胞中,MHBs上调HMGB1的表达,且在24小时达到高值,在L-02和SMMC-7721细胞中,随时间延长,MHBs组HMGB1的表达量逐渐下降;2、MHBs激活MAPKp38/NF-KB以促进IL-6的表达和分泌,这种效应依赖于内质网压力;在Huh7细胞中,MHBs活化NF-κB来上调HMGB1的表达,且引起HMGB1从细胞核转移到胞质;3、HBc通过激活MAPK p38、ERK1/2和NF-κB来促进IL-6的表达和分泌,但此效应与内质网压力无关;在Huh7细胞中,HBc激活NF-κB以促进HMGB1的表达,但不会引起HMGB1从细胞核到胞质的移位;HBc促进Huh7细胞的增殖,HMGB1 siRNA抑制HBc的促增殖作用,同时也抑制HBc对ERK1/2的激活,但对MAPKp38信号通路无影响。研究结论1、同一 HBV蛋白在不同细胞株中引起的效应不一致,同一细胞株对不同HBV蛋白的反应也不同。总体来说,LHBs、MHBs和HBc会引起炎性基因表达的变化;除TNFα外,SHBs对肝细胞/肝癌细胞内其它炎性基因的表达无显著影响;2、MHBs诱导产生内质网压力,激活p38/NF-κB通路,上调IL-6的表达与分泌,增强HMGB1的表达,并导致其从核转移到胞质,表明,MHBs主要作为肝细胞/肝癌细胞的压力性刺激因子起作用;3、HBc 激活 MAPK p38、ERK1/2 和 NF-κB,上调 IL-6 和 HMGB1 的表达,促进肝癌细胞增殖,表明,HBc作为促炎因子和促增殖因子,具有多重作用。