目前,牙周疾病引起的牙周组织缺损的治疗主要包括引导组织再生以及应用组织工程方法通过修复获得牙周新附着,恢复天然牙周组织的解剖结构和支持组织。组织工程的基本方法是将体外培养扩增的正常组织细胞种植于天然的或人工合成的、具有良好的生物相容性和生物降解性的细胞外基质材料上,经过一段时间的培养,将这种细胞生物材料复合体植入机体,以形成新的具有其原来特殊功能和形态的相应组织和器官,达到修复创伤和重建功能的目的。有研究报道[1],以牙周膜细胞为种子细胞,利用组织工程方法成功修复牙周组织。研究表明体外培养的牙囊细胞在一定的诱导条件作用下可以向成骨/成牙骨质细胞的表型分化[2]。那么以牙囊细胞为种子细胞是否可以修复牙周组织缺损呢?联合应用BMP-2和地塞米松是否能促进牙囊细胞体内成骨作用呢?目前尚无报道。本实验首先观察了BMP-2、地塞米松以及二者联合作用对大鼠牙囊细胞体外增殖和分化能力的影响。将不同诱导条件下的牙囊细胞与β-磷酸三钙进行体外复合,观察了细胞在支架材料表面的增殖与贴附情况,并将其植入免疫缺陷小鼠体内,观察BMP-2和地塞米松联合作用是否能够增强牙囊细胞在体内向成骨/成牙骨质细胞的分化能力。本研究的内容如下:第一部分:大鼠牙囊细胞的体外培养及其鉴定目的:体外培养大鼠牙囊细胞(RDFCs),鉴定其细胞来源及表型,为牙周组织再生的研究提供可靠的种子细胞来源。方法:选择出生后6-7d SD仔鼠,分离上、下颌第一、第二磨牙牙胚,取牙囊组织进行原代和传代培养。通过倒置显微镜观察细胞形态及生长情况;波形丝蛋白(Vimentin,VIM)和角蛋白(Cytokeratin,CK)鉴定其细胞来源;免疫组化染色技术检测细胞牙本质基质蛋白1(dentin matrix protein1,DMP1)、骨桥蛋白(osteopontin,OPN)、骨涎蛋白(bone sialoprotein,BSP)、I型胶原(type I collagen,CoL-I)、III型胶原(typeIII collagen,CoL-III)及纤维连接蛋白(fibronectin,FN)的表达。结果:细胞形态呈多形性,有长梭形,纺锤形、不规则三角形等,波形丝蛋白染色阳性,角蛋白染色阴性。免疫组化染色显示DMP1阴性表达,OPN、BSP、CoL-I、CoL-III、FN在胞浆中呈不同程度的阳性表达。结论:大鼠牙囊细胞来源于外胚间充质,具有成纤维细胞的形态特征及成骨/成牙骨质细胞表型特征,可将牙囊细胞作为种子细胞用于牙周组织工程的再生研究。第二部分:BMP-2和地塞米松对体外培养大鼠牙囊细胞生物学特性的影响目的:观察BMP-2、地塞米松、BMP-2/地塞米松联合作用对体外培养大鼠牙囊细胞增殖、分化的影响。方法:取生长状态良好的第3代大鼠牙囊细胞,血清饥饿同步化后,分别加入含BMP-2(100ng/ml)、地塞米松Dex (10-8mol/ml)、BMP-2(100ng/ml)+地塞米松(10-8mol/ml)的DMEM培养液,诱导1d、3d、5d后,利用四唑盐比色法(MTT)检测不同诱导条件下对大鼠牙囊细胞增殖影响。通过碱性磷酸酶(ALP)检测试剂盒、钙化结节染色、RT-PCR检测DMP-1、DSPP、BSP、OCN、Col I基因表达的方法,分别检测不同诱导条件下对大鼠牙囊细胞分化的影响。结果:BMP-2、地塞米松分别诱导均能促进牙囊细胞的增殖,诱导3天后BMP-2作用最为显著,地塞米松则在第1天时促增殖作用最强,其后逐渐降低,然而BMP-2/地塞米松联合作用在各个时间点均能显著促进牙囊细胞的增殖。此外,地塞米松对牙囊细胞的促分化作用强于BMP-2,当两者联合作用时促分化能力最强。结论: BMP-2、地塞米松均能促进牙囊细胞增殖与分化,然而两者联合作用促增殖和分化的能力最为显著,提示其在牙周组织工程中的应用前景。第三部分:BMP-2和地塞米松作用的大鼠牙囊细胞复合β-磷酸三钙生物陶瓷的实验研究目的:以BMP-2和地塞米松诱导的大鼠牙囊细胞作为种子细胞,β-磷酸三钙作为细胞支架材料,体外构建细胞生物材料复合体,观察大鼠牙囊细胞在β-磷酸三钙生物陶瓷材料的贴附、增殖情况。方法:收集培养的第3代RDFCs,血清饥饿同步化后,细胞分为四组,分别为BMP-2、Dex、BMP-2+Dex诱导组及空白对照组。诱导3d后,将密度为4×106/ml的细胞悬液0.1ml均匀接种到预制好的β-TCP支架材料上,分别于体外培养3d、7d取细胞材料复合体,通过细胞计数,扫描电子显微镜观察细胞在材料表面的贴附、增殖情况。结果:细胞计数发现,7d时BMP-2+Dex诱导组细胞数量显著高于BMP-2诱导组、Dex诱导组(p<0.01)。扫描电镜观察,β-TCP表面呈多孔三维立体网状结构。细胞接种3 d和7d时,单位面积内BMP-2+Dex诱导组细胞数量均明显高于BMP-2诱导组、Dex诱导组、对照组。结论:β-磷酸三钙具有良好的生物相容性,利于大鼠牙囊细胞的贴附和生长,证明了BMP-2和地塞米松联合作用促进大鼠牙囊细胞的增殖、分化的协同效应,为进一步使用BMP-2和地塞米松诱导大鼠牙囊细胞,并与β-磷酸三钙生物陶瓷复合后体内移植实验提供依据。第四部分:BMP-2和地塞米松诱导后大鼠牙囊细胞/β-磷酸三钙生物陶瓷复合体在免疫缺陷鼠体内成骨作用的研究目的:观察BMP-2、地塞米松、BMP-2+地塞米松对大鼠牙囊细胞在体内分化能力的影响。方法:将经BMP-2、Dex、BMP-2+Dex诱导后的牙囊细胞与β-TCP生物陶瓷支架材料复合后,移植入免疫缺陷小鼠体内8周,取移植物进行HE染色及Masson染色观察。结果:HE及Masson染色结果均表明,BMP-2/Dex联合诱导组移植物可见骨组织及类骨质形成,并可见血管长入。BMP-2诱导组也可见少量成骨组织。而Dex诱导组、未诱导组及空白对照组均未见骨组织及类骨质形成,但在材料孔隙周围可见细胞及细胞外基质成分。结论:BMP-2/地塞米松协同诱导的大鼠牙囊细胞与β-TCP生物陶瓷复合后,在体内能分化成为成骨/成牙骨质细胞样细胞,并形成骨样组织。为牙囊细胞/生物材料复合体修复牙周组织缺损提供理论依据。