伪狂犬病是由伪狂犬病病毒（Pseudorables virus,PRV）引起的家畜传染性疾病,该病严重影响了畜牧业和威胁着人类健康。PRV属于疱疹病毒属,是一种嗜神经性病毒,可在感染宿主体内建立潜伏感染。潜伏感染中的PRV DNA处于转录沉默状态,难以利用常规的血清学方法进行检测和鉴定,且现有疫苗对潜伏感染态的PRV防控效果甚微,这导致难以从猪场中完全清除PRV。有研究表明,基于CRISPR/Cas的基因编程技术能有效干扰疱疹病毒的早期感染进而阻止病毒的潜伏感染,但存在Cas9蛋白激发免疫反应及脱靶效应的问题。有报道称,预装配的Cas9与sgRNA复合物（ribonucleoprotein,RNP）因具有较短半衰期等特性能有效克服这些问题,有望用于清除潜伏感染的PRV,然而现有的RNP预装配方法存在成本高、周期长等不足。本研究将探讨效率高、成本低、周期短的靶向PRV基因组的Cas9 RNP复合物制备方法,并在PK-15细胞中检测Cas9 RNP复合物干扰PRV复制的效果。实验室前期建立了一种新的高效制备Cas9 RNP的方法,即利用改造的冷休克载体ptac-Cas9-T7sgRNA在大肠杆菌中共表达Cas9蛋白和sgRNA,共表达的Cas9蛋白和sgRNA可在细菌中自组装成Cas9 RNP复合物。该方法可高效、低成本制备Cas9 RNP复合物,将极大扩展其应用。本研究中,我们挑选了PRV早期复制相关基因IE180、EP0和病毒毒力相关的基因US8、US7、UL23为目标,然后构建了针对这5个基因的Cas9 RNP复合物的共表达载体。首先将共表达载体分别转入大肠杆菌细胞中,筛选获得最佳诱导条件为:IPTG终浓度1 m M,培养温度18℃,于220 rpm转速摇床中诱导表达16 h。然后超声波破收获的菌体,利用镍珠纯化重组蛋白,获得的Cas9 RNP复合物纯度可达90%以上,1 L的细菌培养物可获得约7 mg Cas9 RNP复合物。利用实验室高效的载体构建方法和蛋白纯化方法,从载体构建到高纯度目标基因的Cas9 RNP复合物,整个周期只需3天即可完成。本实验进一步在细胞中检测了共表达Cas9 RNP复合物抑制病毒复制的能力。首先分别用不同剂量的PRV(2000×TCID50,200×TCID50,20×TCID50)感染PK-15细胞,然后利用转染试剂将Cas9 RNP复合物转至细胞中,最后收获被感染的细胞上清,利用TCID50实验检测上清中的病毒滴度,进一步评价各个抗PRV的Cas9 RNP复合物抑制病毒增殖的效果。实验结果证实,靶向PRV的EP0、IE180和TK基因的Cas9 RNPs,可对经200×TCID50、2000×TCID50剂量病毒感染的细胞产生明显的抑制病毒增殖的效果,但20×TCID50剂量感染的细胞没有产生明显的抑制作用。并且我们通过序列测定,发现靶向PRV的EP0、IE180和TK基因的Cas9 RNPs对新产生的病毒进行了明显的编辑作用。我们进一步探讨了针对PRV不同基因的多个Cas9 RNPs是否能共同抑制PRV复制。先用2000×TCID50剂量的PRV病毒感染PK-15细胞,再共转入靶向PRV的EP0和TK基因的Cas9 RNPs,结果显示二者共同加入时出现明显叠加的抑病毒增殖效果。实验进一步确定,当细胞量为10^6且感染病毒量不超过200×TCID50时,最少2.5μg的Cas9RNP能有效抑制病毒的增殖。最后我们通过荧光定量实验探讨抗PRV的Cas9 RNPs能否干扰PRV的复制,我们选定PRV的US6为靶基因。实验结果表明,靶向PRV TK基因的Cas9 RNP转染的细胞中US6 mRNA水平降低了20%,靶向PRV EP0基因的Cas9 RNP转染的细胞US6 mRNA水平降低了80%,而二者共转入的细胞中US6 mRNA水平降低了90%,出现了明显的叠加效应。以上结果证实靶向PRV基因组的Cas9 RNP能抑制PRV在细胞中的复制,并且二者共同作用时表现出现明显的协同抑制作用。本文为大肠杆菌共表达的抗PRV的Cas9 RNP在清除PRV病毒的研究上奠定了基础。