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目前研究miRNA功能的遇到的瓶颈是需要全面性的了解microRNA对靶mRNA表达产生的效应影响以及由此导致的细胞通路和细胞表型的改变。而要认识miRNA对细胞表型的改变,就需要知道每种miRNA在体内的调控靶标有哪些。实验数据和生物信息学预测显示每个miRNA可调控数百甚至上千个靶基因。然而,现有的生物信息学方法无法准确地预测miRNA的作用靶标。因此,要深入认识miRNA的生物学功能,使用一个行之有效的实验方法来系统鉴定miRNA作用靶标是一个关键的突破口。本研究工作第一部分利用本实验室最近建立的miRACE (miRNP isolation and miPrime RACE)方法本论文系统性地鉴定了miR-16-1在特定癌细胞内的保守性和非保守性作用靶标,总共得到了330个潜在的miR-16-1的作用靶标,并对其作用靶位点和GoTerm做了初步分析,从中发现了其新的作用机制及生物学功能。细胞进入或停滞在某一个特定的细胞周期通常需要整合、加工或起始一系列信号转导通路.对于这个细胞周期过程起着至关重要功能的是周期蛋白依赖性激酶(cyclin-dpendent kinase,cdk)以及它们所激活的配体—细胞周期蛋白(cyclin).Cyclin E1(CCNE1)通过与Cdk2结合,来调节哺乳细胞从G1期到S期的细胞周期转变.在正常分裂细胞中,CCNE1的有序表达在对于DNA复制的起始、组蛋白的生物合成以及中心体循环扮演着非常重要的作用.然而在许多人类的肿瘤中,CCNE1的表达通常失调,甚至在多种肿瘤中高表达.目前对于它这种表达失调的分子机制还不是非常清楚.在本项研究工作第二部分中,本论文证实CCNE1在转录后水平上受到miR-16-1的调控,它是一种近年来备受关注的新的转录后调控元件.最初的生物信息预测分析显示,在CCNE1的3’UTR区域存在着两个进化上非常保守的miR-16-1的靶位点,在3’UTR的nt229-254 and nt459-492位置.随后我们外源转染miR-16-1进入细胞,发现miR-16-1不仅能够大幅地降低内源的CCNE1的蛋白水平,而且同时能够降低其mRNA水平.并且,外源转染的miR-16-1能够大幅度的降低含有CCNE13’ UTR序列的荧光素酶报告基因的表达,而外源导入anti-miR-16-1明显的激活了这个报告基因的活性.当把在报告基因上的预测的miR-16-1靶位点作点突变以后,这种调节就丧失了.除此之外,本论文还发现外源导入的miR-16-1能够导致细胞周期停滞在G0/G1这个细胞周期,而外源导入anti-miR-16-1能够回复这种表型.进一步的研究还发现,使用siRNA将CCNE1沉默以后,产生了与miR-16-1作用相似的细胞表型,使细胞停滞在GO/G1期,并且能够部份回复anti-miR-16-1所导致的细胞表型.概括而言,本项研究揭示了miR-16-1在肿瘤中通过靶定CCNE1基因,在调节细胞进程过程中发挥了重要的作用.这从而提供了miR-16-1在肿瘤治疗中存在着潜在的应用价值.