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α-1,3半乳糖转移酶(α-1,3-galactosyltransferase, a-1,3GT)基因又被称为GGTA1基因,其编码的α-1,3半乳糖转移酶负责催化细胞表面Galα1-3Gal-β1-4GlcNAc-R结构的糖表位,(?)α-Gal表位合成。由于人类在进化过程中GGTA1基因失活,α-Gal表位丢失,并相应地产生了大量该表位的天然抗体,因此,α-13-半乳糖苷转移酶是异种器官移植中产生超急性免疫排斥(hyperacute rejection, HAR)的主要诱因。为探讨应用RNAi技术沉默GGTA1基因的效率,本研究针对广西巴马小型猪α-1,3GT基因,设计并构建了GGTA1基因过表达载体以及特异性RNAi干扰载体,并在细胞水平对其沉默效率进行检测,为将来进一步获得α-1,3GT基因沉默巴马小型猪,构建异种器官移植用巴马小型猪模型奠定基础。本试验根据NCBI上发布的猪α-1,3GT基因cDNA序列设计引物,且在引物上下游分别加入HindⅢ与BamHⅠ两个酶切位点。以广西巴马小型猪肝脏组织中的总RNA为模板,进行RT-PCR。产物经纯化,连接,转化和扩增后测序。测序结果显示分别成功克隆得到了广西巴马小型猪缺失第五外显子(GGTA1-1,1080bp)的GGTA1基因cDNA序列及完整的GGTA1基因cDNA序列(GGTA1-2,1116bp);将测序正确的阳性克隆质粒pMD18-GGTA1-1、 pMD18-GGTA1-2载体经(?)pDsRed1-N1和HindⅢ双酶切,纯化连接并BamHⅠ构建及pDsRed1-GGTA1-1重组真核表达载体；最后,利pDsRed1-GGTA1-2用脂质体介导法将重组质粒导入PK-15细胞中培养,(Lipofectamine2000)经转染24h后,置于倒置显微镜下观察其在细胞中的表达情况。结果表明重组质粒的均能在PK-15细胞中表达,pDsRed1-GGTA1-1、pDsRed1-GGTA1-2为下一步进行α-1,3GT基因的沉默实验奠定基础。为了筛选能有效抑带(?)GGTA1基因表达的小干扰RNA,本研究利用RNAi技术在PK-15细胞中沉默该基因,并对其沉默效率进行了检测。首先,以pLLU2G载体为骨架,设计并构建了pLLU2G-shGGTA1-1、pLLU2G-shGGTA1-2(?)(?)pLLU2G-shGGTA1-3共3个针对巴马小型猪GGTA1基因的RNAi载体及阴性对照载体pLLU2G-shGGTA1-control。载体通过脂质体法转染PK-15细胞,以pDsRed1-GGTA1-1作为阳性对照,lipofectamine2000与DMEM分别空转作为空白对照。然后分别应用荧光定量PCR(qRT-PCR)与Western blot对其进行沉默效率检测。荧光定量PCR结果显示,pLLU2G-shGGTA1-1、pLLU2G-shGGTA1-2(?)(?)pLLU2G-shGGTA1-3抑制效率分别为85.02%、86.05%和83.85%。阴性对照pLLU2G-shGGTA1-Control、 lipofectamine2000空白对照组一与空转染DMEM空白组二无抑制效果,阳性对照组pDsRed1-GGTA1-1高表达GGTA1基因。Western blot检测结果表明,pLLU2G-shGGTA1-1、pLLU2G-shGGTA1-2和pLLU2G-shGGTA1-3这3个干扰实验组GGTA1蛋白几乎为痕量表达,这与荧光定量PCR检测结果一致。阴性对照组pLLU2G-shGGTA1、Control、lipofectamine2000空白对照组一与空转染DMEM空白组二蛋白表达水平无明显差异,阳性对照组pDsRed1-GGTA1-1中GGTA1蛋白表达水平明显高于空白对照组。以上结果表明,设计得到的GGTA1基因3个shRNA核心序列均能有效抑制GGTA1的表达,其中pLLU2G-shGGTA1-2抑制效率最高,达到86.05%,可用于沉默巴马小型猪的GGTA1基因,构建异种器官移植用的小型猪模型。