研究背景供体短缺是全球性难题,根据中国红十字会的数据显示,在美国供受体的比例为1：5,在英国为1：3,在中国则为1：150。器官短缺使得“扩大标准”的器官,或曾被认为不适合用于移植的器官的使用率大大增加。提高边缘性供肝(特别是中重度脂肪供肝)的利用率被认为在某种程度上可以缓解供肝短缺。但是脂肪肝对缺血再灌注损伤异常敏感,在移植过程中遭受的缺血再灌注损伤和免疫损伤可导致移植肝的原发性无功能或早期功能不良。如何预防和减少IRI是肝脏外科特别是肝移植的研究热点之一。由于间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)具有趋化迁移和组织修复再生等能力,从而广泛应用于各种抗炎性损伤和组织损伤修复等领域中。本研究即探讨人脐带间充质干细胞在大鼠脂肪供肝肝移植中的保护作用和其相关的机制,为提高边缘性供肝的利用率提供一种新的方法。第一部分大鼠脂肪肝模型的建立目的通过喂养高脂饲料建立大鼠中重度脂肪肝模型。方法雄性Sprague Dawley (SD)大鼠20只,体重40-50g。20只大鼠随机分为普通饲料组和高脂饲料组(各10只),两组脂肪供能比为18.23%和48.32%。每天自由饮水和进食,每周称大鼠体重1次,并观察其毛色、食欲、行动、粪便及对外界的反应情况。持续喂养8周后,水合氯醛腹腔注射麻醉,腹主动脉采血,然后处死动物,称取肝脏湿重,计算肝指数(肝湿重/体重×100%)。留取血清标本行血清学指标的检测,肝脏病理检查以评估大鼠脂肪肝的程度。结果1.高脂饲料组大鼠体重和肝指数显著高于普通饲料组。2.高脂饲料组血清谷丙转氨酶(alanine aminotransferase, ALT)、谷草转氨酶(aspartate aminotransferase, AST)和总胆固醇(total cholesterol, TC)水平较普通饲料组明显升高,提示高脂饮食对大鼠肝细胞有一定的破坏作用并造成脂质代谢紊乱。3.HE染色光镜下观察高脂饲料组则出现弥漫性脂肪变性,肝细胞排列紊乱,细胞空泡、气球样变明显,且小叶内有炎性细胞浸润。结论根据血清学指标和病理检测结果,高脂饲料的大鼠的肝脏已经达到中、重度脂肪肝的水平,符合下一步实验的要求,建模成功。第二部分人脐带间充质干细胞对大鼠脂肪肝缺血再灌注损伤的保护作用目的成功分离和扩增人脐带间充质干细胞,并研究其在大鼠中重度脂肪肝缺血再灌注损伤中的作用。方法采用Ⅰ型胶原酶联合透明质酸酶消化Wharton’s Jelly组织的方法分离提取人脐带间充质干细胞,用LG-DMEM和MesenPro等比例混合培养基的体系对huc-MSCs进行扩增。通过高脂饮食建立SD大鼠中重度脂肪肝模型。60只大鼠分为人脐带间充质干细胞处理组(MSC组)和对照组,各30只。MSC组缺血再灌注术前1天和术后第3天分别从尾静脉注射含2×106人脐带间充质干细胞的PBS1.5m1。对照组则在相同时间点单纯注射PBS1.5m1。术后第1、4和7天(每个时间点10只),检测血清谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、肝组织中超氧化物歧化酶活性(superoxidedismutase, SOD)、丙二醛(1nalondialdehyde, MDA)、肿瘤坏死因子-a(tumor necrosis factor-α, TNF-α)的变化。肝组织病理切片HE染色观察肝组织损伤和白细胞浸润情况。结果术后第1、4天,与对照组相比,MSC组血清ALT、AST、TNF-α和肝组织MDA明显降低,两组比较差异有统计学意义(P<0.05)。术后第七天,两组ALT、AST和TNF-α已无明显差异(P>0.05)。而SOD在术后各时间点两组间的比较均无明显差异。肝组织病理检测则发现MSC组肝细胞坏死和白细胞浸润明显较对照组减轻。结论1.我们成功建立了高效的人脐带间充质干细胞的分离扩增方法。2.人脐带间充质干细胞输注能有效减轻大鼠脂肪肝缺血再灌注损伤,有望成为临床肝脏外科和肝移植减轻脂肪肝缺血再灌注损伤的一种新方法。第三部分人脐带间充质干细胞对大鼠脂肪供肝保护作用的机制研究目的探讨人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells, huc-MSCs)对中重度脂肪供肝肝移植的保护作用,分析其可能的保护机制,为提高边缘性供肝的利用率提供新的手段。方法1.实验动物随机分为4组：①正常肝组(n=4),普通饲料喂养8周的Lewis大鼠；②脂肪肝组(n=4),高脂饲料喂养8周的Lewis大鼠；③MSCs组(n=16),脂肪肝肝移植术后从阴茎背静脉静注含2×106huc-MSCs的PBS1.5ml；④对照组(n=16)：脂肪肝肝移植术后从阴茎背静脉单纯静注含PBS1.5ml。2.对照组和MSCs组分别于术后1d、3d各取4只大鼠,留取血清和肝脏标本,两组各剩余的8只大鼠观察术后生存情况。各组留取肝组织标本行MicroRNA (MiRNA)芯片分析。结果1.术后第1、3天,与对照组相比,MSCs组血清ALT、TBIL、TNF-α和肝组织MDA明显降低,两组比较差异有统计学意义(P<0.05)。而SOD在术后各时间点两组间的比较均无明显差异。2.肝组织病理检测则发现MSCs组肝细胞坏死和白细胞浸润明显较对照组减轻。3.对照组和MSCs术后1周的生存率分别为为12.5%和75%,两组大鼠术后的生存率的比较有明显的差异(P<0.05)。表明通过huc-MSCs处理后,脂肪供肝的大鼠发生PNF的几率大大降低。4.脂肪肝脏行肝移植术后1d,miRNA谱发生了很大的变化(29个上调,27个下调)。相比于对照组而言,用huc-MSCs干预后的MSCs组肝移植术后1d的miRNA谱的变化则轻微了许多(上调和下调的MiRNA各有8个)。其中MSCs组和对照组一起上调的有miR-107、miR-186、miR-25、miR-16、miR-34a、miR-339-5p,而miR-291a-5p、miR-490、miR-874、miR-3568则同时下调。而在肝移植术后1d和3d,MSCs组与对照组相比,miR-375均同时上调(2.56倍和4.22倍)结论1. Huc-MSCs可减轻脂肪供肝肝移植术后的IRI和免疫损伤,降低移植术后PNF的发生率,有望成为一种提高中重度脂肪肝等边缘性供肝利用率的新方法。2.脂肪肝行肝移植术后miRNA谱发生了很大的变化,有些miRNA可能在脂肪供肝移植术后的IRI和免疫损伤过程发挥着重要作用。3.有些miRNA在huc-MSCs保护脂肪供肝可能发挥着重要角色,如miR-21、miR-375等。这一部分尚有待下一步的功能学实验加以验证。