本文分三个部分, 分别从肝癌的预防、诊断及基础研究的角度去探讨肝癌发生、发展及转移的分子机理,试图为肝癌防治解决一些具体问题。第一部分针对江苏启东肝癌高发地区乙肝疫苗预防工作中出现的疫苗逃脱现象,分析了可能存在的几种原因,指出乙型肝炎病毒 S 基因中“a”决定簇编码序列发生点突变是该地区疫苗逃脱现象的原因之一,并提示了预防疫苗逃脱变异的重要意义;第二部分分析了游离于不同肝病患者血浆中肝细胞 p53 基因第七外显子 249 密码子的突变情况,指出该分子标记可作为江苏启东肝癌高发地区肝癌早期诊断的一项新指标;第三部分研究了肝癌异常表达基因 RTN4B 和 RTN4C 的初步功能,指出肝癌特异表达蛋白 RTN4B 不仅可作为肝癌病理诊断的一项标记,而且有可能在肝细胞癌变过程中介导了一条新的信号通路。 一、 乙型肝炎病毒(HBV) 的感染是启东高发地区肝癌的主要诱因。预防HBV 的感染是阻止原发性肝癌(HCC)发生的一个最重要的策略。1980 年代,在江苏实施了一项重大的计划,80,000 名出生于 1984 至 1990 年之间的新生儿童接种了乙肝疫苗。三次随访后的结果发现,尽管这批儿童受到了疫苗的保护,仍有 15 名呈疾病症状,表现为血清谷丙转氨酶(ALT)的持续高水平。其中,5 名乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)阴性个体的ALT水平显著地比10名HBsAg阳性个体的 ALT 水平高。我们采集了这 15 名儿童的血样,分别提取了血清中 HBV- DNA,设计引物并克隆了 HBsAg 编码序列。测序结果显示, 5 名 HBsAg 阴性个体表面抗原“a”决定簇编码序列中 530,540,544,558,560,561,587 位 (从 HBV 基因组 的 EcoRI 位 点 算 起 ) 发 生 不 同 的 点 突 变 , 导 致 从 HBsAg 开 始 的126,129,135,136,145 位氨基酸发生改变。我们发现,在 7 个点突变中,有 6 个发生在“a”决定簇内第一个环状结构的编码序列中,导致 “a” 决定簇的126,129,135,136 位 4 个氨基酸残基分别发生替换,1 个发生在“a”决定簇内第二个环状结构的编码序列中,导致 145 位热点突变(Gly → Arg)。“a”决定簇的双环构象非常保守,并且对 HBV 的抗原性很重要。双环构象中的这些改变能逃脱疫苗诱导抗体的中和作用。 二、 中国启东地区肝癌的特征之一是 p53 基因的选择性突变,导致 249 密码子处发生丝氨酸替换。这一突变已被确认为发生在黄曲霉毒素高暴露人群及携带乙型肝炎病毒的高危人群中的一个热点突变。本文对于在中国启东地区肝细胞 8<WP=7>复旦大学博士学位论文 前言癌及肝硬化病人中游离于血浆的 DNA 中能否检测到这种热点突变作出了评估,并试图说明检测这种分子生物标志的意义。 我们在启东地区采集了 25 例肝癌病人,20 例肝硬化患者及 30 例健康人的血样。从各个全血样品的 200μl 血浆中分离 DNA,通过对 p53 基因第 7 外显子 PCR产物的限制性消化分析及直接测序来检测p53基因249Ser突变。我们发现在10/25(40%)的肝癌病人,4/20(20%)肝硬化患者及 2/30(7%)健康对照的血样中,p53 基因第 7 外显子 249 密码子第 3 碱基处发生 G→T 颠换,导致 249 密码子编码的精氨酸变成丝氨酸。这些资料显示,血浆中 249Ser p53 突变与启东肝癌病人密切相关。我们同时发现在启东的硬化患者及健康对照人中也能检测到的血浆249Ser p53 突变,尽管他们的频率相当低。我们认为,该突变的检测结合常规的诊断方法,可以为肝癌的早期诊断提供更多信息。血浆 249Ser p53 突变应开发成为一种新的肝癌的早期诊断的标志。 三、 RTN(Reticulon)是一个多功能的基因家族。该家族中基因所编码的蛋白主要定位于内质网。迄今为止,已发现的 RTN 基因家族有四个成员,即 RTN1,RTN2,RTN3 和 RTN4。RTN4 是我们复旦大学遗传所人类新基因研究室克隆到的一个基因。RTN4B 在 16 种正常人组织中表达情况的 Northern 杂交分析已表明,该基因除肝脏以外的其余 15 种组织中均表达,在 12 对肝癌组织的 Northern 杂交分析中,RTN4B 呈现显著的上调表达。而 RTN4C 在正常人肝组织有表达,在 12 对肝癌组织的 Northern 杂交分析中,RTN4C 呈现显著的下调表达。我们认为 RTN4B 和 RTN4C 是肝癌中异常表达的基因。 在这样的工作基础上,我们采用 Western 印迹技术分别对 RTN4B 和 RTN4C基因在人肝癌及正常肝组织中的蛋白表达水平作了检测。利用 RT-PCR 方法分析了 RTN4B 和 RTN4C 基因在大鼠模型中不同发育阶段的表达情况。这些表达谱分析提示,RTN4B 基因的关闭与开启与肝癌的发生密切相关。 为探索 RTN4B 基因的生理功能,我们采用酵母双杂交的方法筛选 RTN4B 的互作蛋白。结果发现 RTN4B 能与 BAP2-β[脑特异性血管生成抑制物(brain-specific angiogenesis inhibitor, BAI1)的结合蛋白] 互作。BAP2-β是一种胰岛素受体酪氨酸激酶的底物(IRSp53)。我们采用免疫共沉淀及细胞荧光共定位的方法进一步验证了 RTN4B 与 BAP2-β之间的蛋白分子互作。RTN4B 的另一互作蛋白为层粘连蛋白 LAMA4 。免?