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稻瘟病是水稻的三大病害之一,给世界水稻种植带来了严重的产量损失。培育并种植优良的抗稻瘟病水稻品种是最为经济有效的防控措施。目前,借助于分子标记技术,从DNA水平上对稻瘟病菌进行深入的遗传学研究分析,为培育具有广谱、持久抗稻瘟病水稻新品种提供了重要的理论依据。随着DNA分子标记技术的发展,标记辅助选择(Marker-assisted selection,简称MAS)技术被广泛应用于稻瘟病菌无毒基因的研究,已成为快速准确选择和鉴定无毒基因的有效方法。近年来,稻瘟病菌无毒基因SNP的发掘与鉴定,为基于无毒基因SNP的DNA标记技术的开发奠定了基础。目前已发现稻瘟病菌无毒基因AVR-Pik有5个等位基因(AVR-Pik-A、B、C、D 和 E)(Yoshidaetal.,2009;Kanzakietal.,2012)。本研究利用稻瘟病菌无毒基因AVR-Pik的5个等位基因(AVR-Pik-A、B、C、D和E)序列之间特异的SNP(SNP136、SNP139、SNP143、SNP200 和 SNP234),设计开发了 3 个 SNP 共显性标记:CM-136、CM-200和CM-234。共显性标记CM-136可以将5类等位基因分为3类:AVR-Pik-A/B、AVR-Pik-D、AVR-Pik-C/E,再利用共显性标记CM-200区分AVR-Pik-C和AVR-Pik-E,最后利用共显性标记CM-234区分AVR-Pik-A和AVR-Pik-B。利用该标记系统对特定稻区稻瘟病菌群共348个稻瘟病菌单孢进行鉴定,快速检测出了 269个可能含有稻瘟病菌无毒基因AVR-Pik的单孢和16个可能不含无毒基因AVR-Pik的单孢。选取了本实验室已测序确定过等位基因类型的5个单孢进行PCR扩增反应,琼脂糖凝胶结果验证这5个单孢含有的等位基因与测序检测的一致;之后随机选取24个可能含有无毒基因AVR-Pik的单孢,进一步测序,结果显示24个单孢中含有的无毒基因AVR-Pik的序列,与相应的5个无毒基因AVR-Pik的等位基因CDS的序列完全一致,从而验证了共显性分子标记的有效性。未检测到稻瘟病菌无毒基因AVR-Pik的16个单孢,根据无毒基因AVR-Pik-D的序列设计3对引物D1、D2和D3对这16个单孢和一个已知含有无毒基因AVR-Pik-D的对照组单孢HLJ9-1进行鉴定,结果仍表明这16个单孢可能不含稻瘟病菌无毒基因AVR-Pik。稻瘟病菌无毒基因AVR-Pik共显性标记对348个稻瘟病菌单孢的鉴定结果可用于分析无毒基因AVR-Pik的组成、分布和出现频率。对来自7个省份和鉴别菌株的269个单孢的检测结果显示,祖先型等位基因AVR-Pik-D分布最广数量最多,在7个省份和鉴别菌种中均有出现,其出现频率OF达50.93%,由AVR-Pik-D进化而来的AVR-Pik-E在本研究的分布仅次于AVR-Pik-D,除黑龙江,安徽和福建,在本研究中其他省份均有出现,其OF为19.33%。之后进化出的AVR-Pik-A和AVR-Pik-C在出现频率明显少于AVR-Pik-D和AVR-Pik-E,他们的OF分别为7.81%和1.86%,最后进化出的AVR-Pik-B的OF为20.07%,本研究中仅在湖北,黑龙江和鉴别菌株中存在。等位基因AVR-Pik-D可为Pik位点的等位基因Pik、Pikp、Pikm、Piks和Pikh识别;AVR-Pik-E可为Pik、Pikp和Aiks识别;AVR-Pik-A可为Pikm识别,而AVR-Pik-C与已知的Pik的等位基因无法相互识别,而AVR-Pik-B是否具有无毒基因功能至今未被验证。利用10份抗源材料及138个已确定含有无毒基因AVR-Pik的单孢进行稻瘟病菌活体接种实验,实验结果表明含有AVR-Pik不同等位基因的单孢对含Pik等位基因的水稻材料的致病率存在一定差异,在本研究中无毒基因被越少的抗性基因识别,其致病率越高,例如识别无毒基因AVR-Pik-A的抗性基因的数量少于AVR-Pik-E,AVR-Pik-A的致病率平均值为57.30%,大于AVR-Pik-E达40.48%的致病率。该研究结果可为水稻品种布局和抗病品种培育中抗病基因的选择,提供重要依据。